Autologe endotheliale voorlopercellen (EPC's) uit perifeer bloed bij de behandeling van kritieke ischemie van ledematen

Soort van de studie. Toekomstig enkelvoudig centrum niet gerandomiseerd. Doel van de studie. Beoordelen van de veiligheid, haalbaarheid en werkzaamheid van lokale intramusculaire toediening van autologe geselecteerde CD 133+-cellen bij patiënten die lijden aan CLI.

Alle geïncludeerde patiënten leden aan CLI volgens de TASC 2-definities en hadden geen optie voor revascularisatie op basis van contrast-CT of angiografie. Een gedetailleerde geïnformeerde toestemming, goedgekeurd door onze EC, was vereist. Een leeftijd lager dan 18 jaar en hoger dan 70 jaar vanwege een slechte respons van het beenmerg op medicijnsimulatie bij ouderen Klinische instabiliteit van de CLI, zoals gangreen waarvoor een grote amputatie nodig is en een slechte levensverwachting, werden geïntroduceerd als uitsluitingscriteria voor veronderstelde latentie van de EPC's actie. Ernstige systemische ziekte werd geacht het risico op mergstimulatie te verhogen. Patiënten met allergische diathese, vruchtbare leeftijd, eerder EPC-spierimplantaat, eerder medisch experimenteel protocol en belangenverstrengeling met de studie werden uitgesloten.

Patiënten: we schrijven patiënten in met een voorgeschiedenis van Rutherford stadium 4 (rustpijn) of 5 (kleine ischemische laesies) PAD. Alle patiënten hebben eerdere (contrast CT, MR of angiografie) vasculaire beeldvorming ondergaan met uitzondering van opties voor revascularisatie, zowel endovasculair als open, en voldeden aan de inschrijvings- en uitsluitingscriteria. Elke patiënt ondergaat routinematig lichamelijk en instrumenteel onderzoek, inclusief elektrocardiogram, röntgenfoto van de borstkas en analyse van bloedmonsters. Jongere patiënten voldeden aan de criteria voor de ziekte van Buerger, terwijl anderen pure atherosclerotische laesies hadden.

CEUS Imaging-protocol. Twee operators (F.C. en A.G., met respectievelijk 20 en 3 jaar ervaring) die blind zijn voor de behandeling, voeren contrastversterkte echografie uit voor alle patiënten. Er worden twee Amerikaanse scanners (Philips iU22 (Bothell, WA, VS) met lineaire array L9-3-transducer en GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, VS) met lineaire array L6-9-transducer gebruikt.

De beeldparameters zijn: verminderd zendvermogen (mechanische index <0,06), met ongeveer 7-10 frames per seconde en één focus ver onder het niveau van het doel om een ​​meer uniform drukveld te garanderen. Dual-mode presentatie van een grijswaardenbeeld naast het contrastbeeld vergemakkelijkte real-time identificatie van anatomische structuren en ROI-selectie. Er werden beeldlussen van ongeveer 60 seconden verkregen. Er werd getracht een gelijkmatige versterking over het beeld te krijgen en versterkingsverzadiging te voorkomen. De TGC (Time Gain Compensation) was zo ingesteld dat voordat het contrast arriveerde een egaal zwart beeld werd getoond. Een flesje contrastmiddel (SonoVue BR1; Bracco, Milaan, Italië) wordt bereid in een concentratie van ongeveer 2x108 met zwavelhexafluoride gevulde microbellen per milliliter, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voorafgaand aan elke injectie worden microbellen geresuspendeerd door de injectieflacon te schudden. De positie van de sonde wordt voor elke patiënt geregistreerd om tijdens de follow-up dezelfde positie te behouden. De contrastinjectie bestaat uit een intraveneuze bolus van 4,8 ml contrastmiddel die in 2 seconden in de antecubitale ader wordt geïnjecteerd, gevolgd door een spoeling met zoutoplossing van 5 ml. De injectie wordt gegeven met de patiënt in rugligging en na 10 minuten rust om inspanningsgerelateerde microvasculaire dilatatie te voorkomen. De radioloog houdt met behulp van het weefsel (fundamenteel beeld) van de beeldvormingsmodus "Contrast Side/Side" een constant beeldvlak in stand.

Foto analyse. De beeldlussen worden overgebracht naar een personal computer voor verdere analyse. De belangrijkste beeldanalysetaken zijn: a) identificatie van het gebied van de tibialis anterior artery (TAA), b) selectie van een representatief gebied van de normale tibialis anterior-spier (TAM) en c) formulering van tijd-intensiteitscurven. Twee handmatig gedefinieerde interessegebieden (ROI), 2 cm en 4 cm zijdige vierkanten, worden respectievelijk over de tibialis anterieure spier geplaatst zonder tekenen van arteriële takken, over de tibialis anterieure arterie en over een kleine tibialis arteriële tak. De ROI's worden voor elke patiënt in dezelfde anatomische positie geplaatst om ongewenste verschillen tijdens vervolgonderzoeken te voorkomen. Voor elke ROI wordt een tijd/intensiteitscurve (TIC) verkregen. Uit een analyse van CEUS-tijd-intensiteitscurven berekenen we de regionale bloedstroom (RBF) en het volume (RBV). Tijd-intensiteitscurven worden geëxtraheerd met behulp van commerciële kwantificeringssoftware (QontraXt v.3.60, AMID, Rome, Italië). Deze software maakt handmatige selectie van het interessegebied (ROI) mogelijk, meting van het geselecteerde ROI-gebied en biedt lineaire gegevens voor de tijd-intensiteitscurven. Voor de ROI in het normale ATM wordt er naar gestreefd om de regio in een gebied te plaatsen zonder grote schepen. De ROI van de ATA is een vierkant van 2 cm en de ATM ROI is een vierkant van 4 cm. Tijd-intensiteitscurven worden verkregen door de gemiddelde intensiteit van pixels binnen de ROI op elk tijdstip te berekenen. Voor elke beeldlus worden berekend:

• RBV die bestaat uit de totale hoeveelheid contrastmiddelen binnen de geselecteerde ROI, in een bepaalde periode. Vanwege de kenmerken van Amerikaanse contrastmiddelen weerspiegelt het de hoeveelheid bloed in een bepaald gebied. Het is direct gerelateerd aan het gebied onder de curve (AUC).
• RBF die in directe verhouding staat tot perfusie in een gegeven ROI. Het bestaat uit de stroom contrastmedia (gerelateerd aan de bloedstroom) in een geselecteerde ROI. Het is gerelateerd aan de gemiddelde transittijd.

Beenmerg stimulatie. Humane recombinant granulocyt-koloniestimulerende factor (rhGCSF) wordt gedurende 4-5 opeenvolgende dagen subcutaan toegediend in een dosering van 10 µg/kg per dag, verdeeld over 2 doses. Vanaf de derde dag van mobilisatie wordt het aantal CD133+-cellen dagelijks gecontroleerd door middel van cytofluorimetrische analyse op een monster van 2 ml uit het perifere bloed van de patiënt. Het minimale aantal CD133+-cellen dat acceptabel is voor leukaferese (LKF)-verzameling was 10/µl. Patiënten worden gecontroleerd op G-CSF-gerelateerde bijwerkingen.

Leukaferese collectie. Voor elke patiënt wordt een enkele LKF-afname gepland met behulp van een celscheidingsapparaat van de derde generatie (Spectra Cobe, Lakewood, CO), dat ten minste 2,5 bloedvolumes verwerkt volgens ons interne protocol voor stamcelafname. Tijdens de gehele afnameprocedure worden patiënten gecontroleerd op bloeddruk en hartslag. Onmiddellijk na LKF wordt een monster uit het perifere bloed van de patiënt genomen voor hemocytometrische analyse om het aantal bloedplaatjes en de Hb-waarden te evalueren. Elke leukaferesecollectie wordt verdund met 10% acide citrate dextrose (ACD-A) en gedurende de nacht op 4°C gehouden vóór immunomagnetische celselectie. Uit elke LKF-zak wordt een monster van 2 ml genomen voor cytofluorimetrische analyse. Vier uur na LKF-verzameling worden coagulatieparameters, elektrolytniveaus en hemocytometrische analyse geëvalueerd.

Immunomagnetische celselectie. CD133 immunomagnetische celselecties worden de dag na LKF-verzameling uitgevoerd met behulp van het Clini-MACS (Miltenyi Biotec)-apparaat volgens het standaardprotocol van de fabrikant. In het kort wordt CliniMACS CD133-reagens (gevormd door superparamagnetische deeltjes samengesteld uit ijzeroxide en dextran geconjugeerd aan muriene monoklonale antilichamen) aan de cellen toegevoegd voor incubatie. Het product wordt vervolgens gewassen door verdunning met buffer (CliniMACS PBS-EDTA-buffer aangevuld met 0,5% humaan serumalbumine) en de celzak wordt aan het apparaat gehangen voor de geautomatiseerde selectie van CD133-gelabelde cellen. Van de positieve fractie wordt een monster van 2 ml genomen voor cytofluorimetrische analyse.

Kwaliteitscontroles. Klonogene testen. Een monster dat na elke selectieprocedure voor immunomagnetische cellen uit de CD133-celpositieve fractie is genomen, wordt uitgezaaid voor kortdurende (14 dagen) klonogene assays. Er wordt een standaardmengsel van methylcellulose plus recombinant humaan erytropoëtine, rh-stamcelfactor (SCF), rhGM-CSF en rh-interleukine-3 (IL-3) gebruikt (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Duitsland). Microbiële culturen. Microbiële culturen op de immunoselectie-afvalzak met daarin de negatieve fractie worden uitgevoerd om aerobe-anaerobe bacteriën en schimmelbesmetting op te sporen. Een monster van 10 ml wordt geïnoculeerd in het kweekmedium (Bact/Alert FA en BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) en gedurende 10 dagen bij 37°C geïncubeerd.

Cytofluorimetrische analyse. Monsters verkregen uit perifeer bloed vóór mobilisatie met G-CSF, op het moment van leukaferese en na immunomagnetische celselectie worden geanalyseerd door flowcytometrie om de expressie van specifieke stamcel- en endotheliale antigenen te evalueren. Becton Dickinson FACSCanto werd gebruikt voor alle flowcytometrische assays met een lyse no-wash-techniek, waarbij de volgende monoklonale antilichamen werden gebruikt: anti-CD45 fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinin-chlorofyl-eiwit complex (PerCP) (8G12-kloon, Becton Dickinson), anti-CD133-fycoerythrine (PE) (AC133-kloon, Miltenyi Biotec) en anti-VEGF-R2-allophycocyanine (APC) (R&D-systemen). Volbloed wordt verwerkt volgens de instructies voor VEGF-R2 (KDR)-bepaling. Elk bloedmonster wordt overgebracht naar een falcon-buis van 50 ml en op een totaal volume van 30 ml gebracht door toevoeging van ammoniumfosfaat bevattende lysisbuffer (Becton Dickinson). Na een lysisperiode van 5 minuten wordt PB gedurende 5 minuten bij 500 g gecentrifugeerd en tweemaal gewassen met PBS dat 0,5% runderserumalbumine (BSA) bevat. 100 µl van elk monster wordt vervolgens overgebracht in een BD-buis voor cytometrische analyse en gedurende 15 minuten geïncubeerd met 1 µg/105 cellen IgG om alle niet-specifieke plaatsen te blokkeren. 50 µl van het IgG-geblokkeerde monster wordt geïncubeerd met 20 µl anti-VEGF-R2-antilichaam gedurende 30 minuten bij 4°C in het donker en daarna tweemaal gewassen met PBS. Aan het einde van de laatste wasstap wordt 10 µl van elk van de andere antilichamen (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) toegevoegd en 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Elk monster wordt verkregen met BD FACSCanto-opname 100.000 gebeurtenissen binnen de lymfocyten plus monocytenpoort. Gegevensbestanden worden geanalyseerd met FACS Diva 6.1 software. De levensvatbaarheid wordt beoordeeld met behulp van 7-amino-actinomycine D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Voor en na mobilisatie (op het moment van LKF-afname) wordt een monster genomen voor Hill- en EBM2-klonogene assays uit het perifere bloed van de patiënt.

Implantatie procedure. Na locoregionale anesthesie en huiddesinfectie onder de knie wordt 45-48 ml autologe CD133+-zoutoplossingsuspensie intramusculair toegediend met een diepe injectie van 1 ml via een 18G-naald. De injecties waren zo verdeeld: 10 ml in het voorste compartiment van het been, 10 ml in het oppervlakkige achterste compartiment, 10 ml in het diepe achterste compartiment, 10 ml in het laterale compartiment en het resterende deel in de voet.

Baseline-evaluatie en follow-up. Pijnbeoordeling wordt uitgevoerd met een persoonlijke schaal van 3 graden (licht, matig en ernstig) en het gebruik van pijnstillers wordt gecontroleerd. Ischemische laesies worden wekelijks behandeld door een verpleegkundige die bekwaam is in wondbehandeling. Preoperatief en op 3, 6 en 12 maanden na het implantaat worden CEUS, laesie-evolutie en pijnbeheersing beoordeeld.