Autologiczne komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) z krwi obwodowej w leczeniu krytycznego niedokrwienia kończyn

Rodzaj badania. Prospektywny pojedynczy ośrodek bez randomizacji. Cel badania. Ocena bezpieczeństwa, wykonalności i skuteczności miejscowego podania domięśniowego autologicznych wyselekcjonowanych komórek CD 133+ pacjentom cierpiącym na CLI.

Wszyscy włączeni pacjenci cierpieli na CLI zgodnie z definicjami TASC 2 i nie mieli możliwości rewaskularyzacji, na podstawie obrazowania CT z kontrastem lub angiografii. Wymagana była szczegółowa świadoma zgoda, zatwierdzona przez naszą KE. Wiek poniżej 18 lat i powyżej 70 lat z powodu słabej reakcji szpiku na symulację leku u osób w podeszłym wieku Kliniczna niestabilność CLI, taka jak zgorzel wymagająca poważnej amputacji i niska oczekiwana długość życia, zostały wprowadzone jako kryteria wykluczające domniemaną latencję Akcja EPC. Oceniono, że ciężka choroba ogólnoustrojowa zwiększa ryzyko stymulacji szpiku. Wykluczono pacjentów ze skazą alergiczną, w wieku rozrodczym, z wcześniejszym implantem mięśniowym EPC, wcześniejszym medycznym protokołem eksperymentalnym oraz z jakimkolwiek konfliktem interesów z badaniem.

Pacjenci: rejestrujemy pacjentów z PAD stopnia 4. (ból spoczynkowy) lub 5. (niewielkie zmiany niedokrwienne) w wywiadzie. Wszyscy pacjenci mieli wcześniej wykonane (CT, MR lub angiografia z kontrastem) obrazowanie naczyń wykluczające możliwość rewaskularyzacji, zarówno wewnątrznaczyniowej, jak i otwartej, i spełniali kryteria włączenia i wyłączenia. Każdy pacjent przechodzi rutynowe badanie fizykalne i instrumentalne, w tym elektrokardiogram, zdjęcie rentgenowskie klatki piersiowej i analizę próbki krwi. Młodsi pacjenci spełniali kryteria choroby Buergera, podczas gdy inni mieli czyste zmiany miażdżycowe.

Protokół obrazowania CEUS. Dwóch operatorów (F.C. i A.G., odpowiednio z 20 i 3-letnim doświadczeniem), którzy nie znają leczenia, wykonuje USG z kontrastem u wszystkich pacjentów. Zastosowano dwa skanery US (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) z przetwornikiem liniowym L9-3 i GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) z przetwornikiem liniowym L6-9.

Parametry obrazowania to: zmniejszona moc nadawania (indeks mechaniczny <0,06), z szybkością około 7-10 klatek na sekundę i jednym ogniskiem znacznie poniżej poziomu celu, aby zapewnić bardziej jednolite pole ciśnienia. Prezentacja w dwóch trybach obrazu w skali szarości obok obrazu kontrastowego ułatwiła identyfikację struktur anatomicznych w czasie rzeczywistym i wybór ROI. Uzyskano pętle obrazu o długości około 60 sekund. Starano się uzyskać jednolite wzmocnienie na całym obrazie i uniknąć nasycenia wzmocnienia. TGC (kompensacja wzmocnienia czasowego) została ustawiona tak, że przed nadejściem kontrastu wyświetlany był jednolity czarny obraz. Fiolkę środka kontrastowego (SonoVue BR1; Bracco, Mediolan, Włochy) przygotowuje się w stężeniu około 2x108 mikropęcherzyków wypełnionych sześciofluorkiem siarki na mililitr, zgodnie z zaleceniami producenta. Przed każdym wstrzyknięciem mikropęcherzyki zawiesza się przez wstrząsanie fiolką. Pozycja sondy jest zapisywana dla każdego pacjenta w celu utrzymania tej samej pozycji podczas obserwacji. Wstrzyknięcie kontrastu składa się z dożylnego bolusa 4,8 ml środka kontrastowego wstrzykniętego do żyły przedłokciowej w ciągu 2 sekund, po czym następuje przepłukanie 5 ml roztworu soli fizjologicznej. Wstrzyknięcie wykonuje się u pacjenta leżącego na plecach i po 10 minutach odpoczynku, aby uniknąć rozszerzenia mikronaczyniowego związanego z wysiłkiem fizycznym. Radiolog utrzymuje stałą płaszczyznę obrazu za pomocą tkanki (obraz podstawowy) trybu obrazowania „Contrast Side/Side”.

Analiza obrazu. Pętle obrazu są przesyłane do komputera osobistego w celu dalszej analizy. Główne zadania analizy obrazu to: a) identyfikacja obszaru tętnicy piszczelowej przedniej (TAA), b) wybór reprezentatywnego obszaru prawidłowego mięśnia piszczelowego przedniego (TAM) oraz c) sformułowanie krzywych czas-intensywność. Dwa ręcznie zdefiniowane obszary zainteresowania (ROI), kwadraty o bokach 2 cm i 4 cm, umieszcza się odpowiednio nad mięśniem piszczelowym przednim bez śladów rozgałęzień tętniczych, nad tętnicą piszczelową przednią i nad małą tętnicą piszczelową. ROI są umieszczane w tej samej pozycji anatomicznej dla każdego pacjenta, aby uniknąć niepożądanych różnic podczas badań kontrolnych. Dla każdego ROI uzyskuje się krzywą czas/intensywność (TIC). Na podstawie analizy krzywych CEUS czas-intensywność obliczamy regionalny przepływ krwi (RBF) i objętość (RBV). Krzywe czas-intensywność są wyodrębniane przy użyciu komercyjnego oprogramowania do oznaczania ilościowego (QontraXt v.3.60, AMID, Rzym, Włochy). To oprogramowanie umożliwia ręczny wybór obszaru zainteresowania (ROI), pomiar wybranego obszaru ROI i dostarcza danych liniowych dla krzywych czas-intensywność. Dla zwrotu z inwestycji w normalny ATM stara się umieścić region w obszarze bez dużych statków. ROI ATA to 2 cm kwadratowe pole, a ATM ROI to 4 cm kwadratowe pole. Krzywe intensywności w czasie uzyskuje się przez obliczenie średniej intensywności pikseli zawartych w ROI w każdym punkcie czasowym. Dla każdej pętli obrazu obliczane są:

• RBV, na które składa się całkowita ilość środka kontrastowego w obrębie wybranego obszaru ROI w pewnym okresie czasu. Ze względu na charakterystykę amerykańskich środków kontrastowych odzwierciedla ilość krwi w określonym regionie. Jest to bezpośrednio związane z polem pod krzywą (AUC).
• RBF, który jest w bezpośrednim stosunku do perfuzji w danym ROI. Polega na przepływie środka kontrastowego (związanego z przepływem krwi) w wybranym ROI. Jest to związane ze średnim czasem przejścia.

Stymulacja szpiku. Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu kolonii granulocytów (rhGCSF) podaje się podskórnie przez 4-5 kolejnych dni w dawce 10 ug/kg dziennie, podzielonej na 2 dawki. Począwszy od trzeciego dnia mobilizacji, codziennie monitoruje się liczbę komórek CD133+ za pomocą analizy cytofluorymetrycznej na 2 ml próbki pobranej z krwi obwodowej pacjentów. Minimalna dopuszczalna liczba komórek CD133+ do pobrania metodą leukaferezy (LKF) wynosiła 10/µl. Pacjenci są monitorowani pod kątem wszelkich działań niepożądanych związanych z G-CSF.

Kolekcja leukaferezy. Dla każdego pacjenta zaplanowano pojedynczą zbiórkę LKF przy użyciu urządzenia do separacji komórek trzeciej generacji (Spectra Cobe, Lakewood, CO), przetwarzającego co najmniej 2,5 objętości krwi zgodnie z naszym wewnętrznym protokołem pobierania komórek macierzystych. Pacjenci są monitorowani pod kątem ciśnienia krwi i częstości akcji serca podczas całej procedury pobierania. Bezpośrednio po zabiegu LKF pobierana jest próbka krwi obwodowej pacjenta do analizy hemocytometrycznej w celu oceny liczby płytek krwi i poziomu Hb. Każdą kolekcję leukaferezy rozcieńcza się 10% roztworem kwaśnej cytrynianu dekstrozy (ACD-A) i utrzymuje przez noc w temperaturze 4°C przed selekcją komórek immunomagnetycznych. Próbkę 2 ml z każdego worka LKF pobiera się do analizy cytofluorymetrycznej. Cztery godziny po pobraniu LKF ocenia się parametry krzepnięcia, poziom elektrolitów i analizę hemocytometryczną.

Selekcja komórek immunomagnetycznych. Selekcje komórek immunomagnetycznych CD133 przeprowadza się dzień po pobraniu LKF przy użyciu urządzenia Clini-MACS (Miltenyi Biotec) zgodnie ze standardowym protokołem producenta. W skrócie, odczynnik CliniMACS CD133 (utworzony przez superparamagnetyczne cząstki złożone z tlenku żelaza i dekstranu sprzężone z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi) dodaje się do komórek w celu inkubacji. Następnie produkt przemywa się przez rozcieńczenie buforem (bufor CliniMACS PBS-EDTA uzupełniony 0,5% albuminą surowicy ludzkiej) i woreczek z komórkami zawiesza się na urządzeniu do automatycznej selekcji komórek znakowanych CD133. Próbkę 2 ml z frakcji dodatniej pobiera się do analizy cytofluorymetrycznej.

Kontrola jakości. Testy klonogenne. Próbkę pobraną z pozytywnej frakcji komórek CD133 po każdej procedurze immunomagnetycznej selekcji komórek wysiewa się do krótkoterminowych (14 dni) testów klonogennych. Stosuje się standardową mieszaninę metylocelulozy plus rekombinowanej ludzkiej erytropoetyny, rh czynnika komórek macierzystych (SCF), rhGM-CSF i rh interleukiny-3 (IL-3) (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Niemcy). Kultury drobnoustrojów. Hodowle drobnoustrojów na worku na odpady do immunoselekcji zawierające frakcję ujemną przeprowadza się w celu wykrycia bakterii tlenowych i beztlenowych oraz zanieczyszczenia grzybami. Próbkę 10 ml zaszczepia się w pożywce hodowlanej (Bact/Alert FA i BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) i inkubuje przez 10 dni w temperaturze 37°C.

Analiza cytofluorymetryczna. Próbki pobrane z krwi obwodowej przed mobilizacją G-CSF, w czasie leukaferezy i po immunomagnetycznej selekcji komórek są analizowane metodą cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji specyficznych antygenów komórek macierzystych i śródbłonka. Becton Dickinson FACSCanto zastosowano we wszystkich testach cytometrii przepływowej z techniką lizy bez płukania, stosując następujące przeciwciała monoklonalne: anty-CD45 izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anty-CD34 perydynina-chlorofil-białko kompleks (PerCP) (klon 8G12, Becton Dickinson), fikoerytryna (PE) anty-CD133 (klon AC133, Miltenyi Biotec) i allofikocyjanina anty-VEGF-R2 (APC) (systemy badawczo-rozwojowe). Krew pełną przetwarza się zgodnie z instrukcją oznaczania VEGF-R2 (KDR). Każdą próbkę krwi przenosi się do probówki Falcon o pojemności 50 ml i doprowadza do całkowitej objętości 30 ml przez dodanie buforu do lizy zawierającego fosforan amonu (Becton Dickinson). Po 5-minutowym okresie lizy PB odwirowuje się przy 500 g przez 5 minut i przemywa dwukrotnie PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Następnie 100 µl każdej próbki przenosi się do probówki BD do analizy cytometrycznej i inkubuje przez 15 minut z 1 µg/105 komórek IgG w celu zablokowania wszystkich niespecyficznych miejsc. 50 µl zablokowanej próbki IgG inkubuje się z 20 µl przeciwciała anty-VEGF-R2 przez 30 minut w 4°C w ciemności, a następnie dwukrotnie przemywa PBS. Pod koniec ostatniego etapu przemywania dodaje się po 10 µl każdego z pozostałych przeciwciał (anty-CD45, anty-CD34, anty-CD133) i inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Każda próbka jest pozyskiwana za pomocą BD FACSCanto z zapisem 100 000 zdarzenia wewnątrz bramki limfocytów i monocytów. Pliki danych są analizowane za pomocą oprogramowania FACS Diva 6.1. Żywotność ocenia się stosując 7-amino-aktynomycynę D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Próbka do testów klonogennych Hilla i EBM2 jest pobierana z krwi obwodowej pacjenta przed i po mobilizacji (w czasie pobierania LKF).

Procedura implantacji. Po znieczuleniu miejscowo-regionalnym i dezynfekcji skóry poniżej kolana, podaje się domięśniowo 45-48 ml autologicznej zawiesiny soli fizjologicznej CD133+ poprzez głęboką iniekcję 1 ml przez igłę 18G. Iniekcje podzielono w następujący sposób: 10 ml w przedni przedział podudzia, 10 ml w tylny przedział powierzchowny, 10 ml w głęboki tylny przedział, 10 ml w przedział boczny i pozostałą część w stopę.

Ocena linii bazowej i kontynuacja. Ocenę bólu przeprowadza się za pomocą indywidualnej 3-stopniowej skali (łagodny, umiarkowany i silny) oraz monitoruje się stosowanie leków przeciwbólowych. Zmiany niedokrwienne są leczone co tydzień przez wykwalifikowaną pielęgniarkę zajmującą się leczeniem ran. Przed operacją oraz 3, 6 i 12 miesięcy po wszczepieniu implantu ocenia się CEUS, ewolucję zmian chorobowych i zarządzanie bólem.