Autologe endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) aus peripherem Blut bei der Behandlung kritischer Extremitätenischämie

Art der Studie. Potenzielles Einzelzentrum, nicht randomisiert. Ziel der Studie. Bewertung der Sicherheit, Durchführbarkeit und Wirksamkeit der lokalen intramuskulären Verabreichung von autologen ausgewählten CD 133+-Zellen bei Patienten mit CLI.

Alle eingeschlossenen Patienten litten an CLI gemäß den TASC 2-Definitionen und hatten auf der Grundlage von Kontrast-CT oder Angiographie-Bildgebung keine Möglichkeit zur Revaskularisierung. Eine detaillierte, von unserem EK genehmigte Einverständniserklärung war erforderlich. Ein Alter unter 18 Jahren und über 70 Jahren aufgrund einer schlechten Reaktion des Knochenmarks auf Medikamentensimulation bei älteren Menschen. Klinische Instabilität des CLI, wie Gangrän, die eine größere Amputation erfordert, und eine geringe Lebenserwartung wurden als Ausschlusskriterien für die vermeintliche Latenz des CLI eingeführt EPCs-Aktion. Es wurde angenommen, dass eine schwere systemische Erkrankung das Risiko einer Knochenmarkstimulation erhöht. Patienten mit allergischer Diathese, gebärfähigem Alter, früheren EPC-Muskelimplantaten, früherem medizinischem Versuchsprotokoll und jeglichem Interessenkonflikt mit der Studie wurden ausgeschlossen.

Patienten: Wir nehmen Patienten mit pAVK im Rutherford-Stadium 4 (Ruheschmerz) oder 5 (kleine ischämische Läsionen) in der Vorgeschichte auf. Alle Patienten hatten zuvor eine Gefäßbildgebung (Kontrast-CT, MR oder Angiographie) mit Ausnahme von Revaskularisierungsoptionen, sowohl endovaskulär als auch offen, und erfüllten die Aufnahme- und Ausschlusskriterien. Jeder Patient wird einer routinemäßigen körperlichen und instrumentellen Untersuchung unterzogen, einschließlich Elektrokardiogramm, Röntgenaufnahme des Brustkorbs und Analyse von Blutproben. Jüngere Patienten erfüllten die Kriterien der Buerger-Krankheit, während andere reine atherosklerotische Läsionen aufwiesen.

CEUS-Bildgebungsprotokoll. Zwei Bediener (F.C. und A.G., mit 20 bzw. 3 Jahren Erfahrung), die für die Behandlung blind sind, führen bei allen Patienten eine kontrastmittelverstärkte US-Untersuchung durch. Es werden zwei US-Scanner (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) mit linearem Array-L9-3-Wandler und GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) mit linearem Array-L6-9-Wandler verwendet.

Die Bildgebungsparameter sind: reduzierte Sendeleistung (mechanischer Index <0,06), mit ca. 7-10 Bildern pro Sekunde und einem Fokus deutlich unterhalb der Zielebene, um ein gleichmäßigeres Druckfeld zu gewährleisten. Die Dual-Mode-Darstellung eines Graustufenbildes neben dem Kontrastbild erleichterte die Identifizierung anatomischer Strukturen und die ROI-Auswahl in Echtzeit. Es wurden Bildschleifen von ca. 60 Sekunden aufgenommen. Es wurde darauf geachtet, eine gleichmäßige Verstärkung über das gesamte Bild zu erzielen und eine Sättigung der Verstärkung zu vermeiden. Der TGC (Time Gain Compensation) wurde so eingestellt, dass vor dem Eintreffen des Kontrasts ein gleichmäßig schwarzes Bild angezeigt wurde. Gemäß den Empfehlungen des Herstellers wird eine Durchstechflasche mit Kontrastmittel (SonoVue BR1; Bracco, Mailand, Italien) mit einer Konzentration von etwa 2x108 mit Schwefelhexafluorid gefüllten Mikrobläschen pro Milliliter vorbereitet. Vor jeder Injektion werden die Mikrobläschen durch Schütteln der Durchstechflasche resuspendiert. Die Position der Sonde wird für jeden Patienten aufgezeichnet, um während der Nachsorge die gleiche Position beizubehalten. Die Kontrastmittelinjektion besteht aus einem intravenösen Bolus von 4,8 ml Kontrastmittel, der innerhalb von 2 Sekunden in die Vena antecubitalis injiziert wird, gefolgt von einer Kochsalzlösung mit 5 ml. Die Injektion erfolgt in Rückenlage des Patienten und nach 10 Minuten Ruhe, um eine belastungsbedingte mikrovaskuläre Erweiterung zu vermeiden. Mit Hilfe des Gewebes (Grundbild) des Bildgebungsmodus „Kontrast Seite/Seite“ hält der Radiologe eine konstante Bildebene aufrecht.

Bildanalyse. Die Bildschleifen werden zur weiteren Analyse auf einen Personalcomputer übertragen. Die Hauptaufgaben der Bildanalyse sind: a) Identifizierung des Bereichs der Tibialis-anterior-Arterie (TAA), b) Auswahl einer repräsentativen Region des normalen Tibialis-anterior-Muskels (TAM) und c) Formulierung von Zeit-Intensitätskurven. Zwei manuell definierte Bereiche von Interesse (ROI), Quadrate mit einer Seitenlänge von 2 cm und 4 cm, werden jeweils über dem Tibialis-anterior-Muskel ohne Anzeichen von Arterienästen, über der Tibialis-anterior-Arterie und über einem kleinen Tibialis-Arterienast platziert. Die ROIs werden für jeden Patienten in der gleichen anatomischen Position platziert, um unerwünschte Unterschiede bei Nachuntersuchungen zu vermeiden. Für jeden ROI wird eine Zeit-/Intensitätskurve (TIC) erstellt. Aus einer Analyse der CEUS-Zeit-Intensitätskurven berechnen wir den regionalen Blutfluss (RBF) und das Volumen (RBV). Zeit-Intensitätskurven werden mit kommerzieller Quantifizierungssoftware (QontraXt v.3.60, AMID, Rom, Italien). Diese Software ermöglicht die manuelle Auswahl der Region of Interest (ROI), die Messung des ausgewählten ROI-Bereichs und liefert lineare Daten für die Zeit-Intensitätskurven. Für den ROI im normalen ATM wird versucht, die Region in einem Gebiet ohne große Schiffe anzusiedeln. Der ROI des ATA beträgt eine quadratische Fläche von 2 cm und der ROI des ATM beträgt eine quadratische Fläche von 4 cm. Zeit-Intensitätskurven werden durch die Berechnung der mittleren Intensität der im ROI enthaltenen Pixel zu jedem Zeitpunkt erhalten. Für jede Bildschleife werden berechnet:

• RBV, das aus der Gesamtmenge an Kontrastmitteln innerhalb des ausgewählten ROI in einem bestimmten Zeitraum besteht. Aufgrund der Eigenschaften von US-Kontrastmitteln spiegelt es die Blutmenge in einem definierten Bereich wider. Sie steht in direktem Zusammenhang mit der Fläche unter der Kurve (AUC).
• RBF, der in direktem Verhältnis zur Perfusion in einem bestimmten ROI steht. Es besteht aus dem Kontrastmittelfluss (bezogen auf den Blutfluss) in einem ausgewählten ROI. Es hängt mit der mittleren Transitzeit zusammen.

Stimulation des Knochenmarks. Der humane rekombinante Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (rhGCSF) wird an 4–5 aufeinanderfolgenden Tagen in einer Dosierung von 10 µg/kg täglich, aufgeteilt in 2 Dosen, subkutan verabreicht. Ab dem dritten Tag der Mobilisierung wird die CD133+-Zellzahl täglich durch zytofluorimetrische Analyse an einer 2-ml-Probe aus dem peripheren Blut des Patienten überwacht. Die für die Leukapherese (LKF)-Sammlung akzeptable Mindestzahl an CD133+-Zellen betrug 10/µl. Die Patienten werden auf etwaige Nebenwirkungen im Zusammenhang mit G-CSF überwacht.

Leukapherese-Sammlung. Für jeden Patienten ist eine einzelne LKF-Sammlung unter Verwendung eines Zellseparatorgeräts der dritten Generation (Spectra Cobe, Lakewood, CO) geplant, das mindestens 2,5 Blutvolumina gemäß unserem internen Protokoll für die Stammzellsammlung verarbeitet. Während des gesamten Entnahmevorgangs werden der Blutdruck und die Herzfrequenz der Patienten überwacht. Unmittelbar nach der LKF wird eine Probe aus dem peripheren Blut des Patienten zur hämozytometrischen Analyse entnommen, um die Thrombozytenzahl und den Hb-Spiegel zu bestimmen. Jede Leukapherese-Sammlung wird mit 10 % saurer Citrat-Dextrose (ACD-A) verdünnt und vor der immunmagnetischen Zellselektion über Nacht bei 4 °C aufbewahrt. Für die zytofluorimetrische Analyse wird aus jedem LKF-Beutel eine Probe von 2 ml entnommen. Vier Stunden nach der LKF-Entnahme werden Gerinnungsparameter, Elektrolytspiegel und eine hämozytometrische Analyse ausgewertet.

Immunmagnetische Zellselektion. Die Auswahl immunomagnetischer CD133-Zellen wird am Tag nach der LKF-Entnahme mit dem Clini-MACS-Gerät (Miltenyi Biotec) gemäß dem Standardprotokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, wird den Zellen zur Inkubation das CliniMACS CD133-Reagenz (gebildet aus superparamagnetischen Partikeln aus Eisenoxid und Dextran, konjugiert mit murinen monoklonalen Antikörpern) zugesetzt. Anschließend wird das Produkt durch Verdünnung mit Puffer (CliniMACS PBS-EDTA-Puffer, ergänzt mit 0,5 % Humanserumalbumin) gewaschen und der Zellbeutel zur automatisierten Selektion CD133-markierter Zellen an das Gerät gehängt. Von der positiven Fraktion wird eine Probe von 2 ml zur zytofluorimetrischen Analyse entnommen.

Qualitätskontrollen. Klonogene Tests. Eine Probe, die nach jedem immunmagnetischen Zellselektionsverfahren aus der CD133-Zell-positiven Fraktion entnommen wird, wird für klonogene Kurzzeittests (14 Tage) ausgesät. Es wird eine Standardmischung aus Methylcellulose plus rekombinantem menschlichem Erythropoietin, rh-Stammzellfaktor (SCF), rhGM-CSF und rh-Interleukin-3 (IL-3) verwendet (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada; MACS Media, Miltenyi Biotec). GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland). Mikrobielle Kulturen. Mikrobielle Kulturen auf dem Abfallbeutel der Immunoselektion, der die negative Fraktion enthält, werden durchgeführt, um eine Kontamination mit aerob-anaeroben Bakterien und Pilzen zu erkennen. Eine Probe von 10 ml wird in das Kulturmedium (Bact/Alert FA und BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) geimpft und 10 Tage lang bei 37 °C inkubiert.

Zytofluorimetrische Analyse. Proben aus peripherem Blut vor der Mobilisierung mit G-CSF, zum Zeitpunkt der Leukapherese und nach der immunmagnetischen Zellselektion werden mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Expression spezifischer Stammzell- und Endothelantigene zu bewerten. Becton Dickinson FACSCanto wurde für alle durchflusszytometrischen Tests mit einer Lyse-No-Wash-Technik unter Verwendung der folgenden monoklonalen Antikörper eingesetzt: Anti-CD45-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), Anti-CD34-Peridinin-Chlorophyll-Protein Komplex (PerCP) (8G12-Klon, Becton Dickinson), Anti-CD133-Phycoerythrin (PE) (AC133-Klon, Miltenyi Biotec) und Anti-VEGF-R2-Allophycocyanin (APC) (F&E-Systeme). Vollblut wird gemäß den Anweisungen zur VEGF-R2 (KDR)-Bestimmung verarbeitet. Jede Blutprobe wird in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt und durch Zugabe von Ammoniumphosphat enthaltendem Lysepuffer (Becton Dickinson) auf ein Gesamtvolumen von 30 ml gebracht. Nach einer Lyseperiode von 5 Minuten wird PB 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen, das 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält. 100 µl jeder Probe werden dann zur zytometrischen Analyse in ein BD-Röhrchen überführt und 15 Minuten lang mit 1 µg/105 Zellen IgG inkubiert, um alle unspezifischen Stellen zu blockieren. 50 µl der IgG-blockierten Probe werden mit 20 µl Anti-VEGF-R2-Antikörper 30 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert und anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Am Ende des letzten Waschschritts werden jeweils 10 µl der anderen Antikörper (Anti-CD45, Anti-CD34, Anti-CD133) zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Jede Probe wird mit BD FACSCanto erfasst und zeichnet 100.000 auf Ereignisse innerhalb des Lymphozyten- und Monozyten-Tors. Datendateien werden mit der Software FACS Diva 6.1 analysiert. Die Lebensfähigkeit wird mit 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR) beurteilt. Aus dem peripheren Blut des Patienten wird vor und nach der Mobilisierung (zum Zeitpunkt der LKF-Entnahme) eine Probe für klonogene Hill- und EBM2-Tests entnommen.

Implantationsverfahren. Nach lokoregionaler Anästhesie und Hautdesinfektion unterhalb des Knies werden 45–48 ml autologe CD133+-Kochsalzlösungssuspension intramuskulär mit 1 ml tiefer Injektion durch eine 18G-Nadel verabreicht. Die Injektionen wurden wie folgt verteilt: 10 ml im vorderen Bereich des Beins, 10 ml im oberflächlichen hinteren Bereich, 10 ml im tiefen hinteren Bereich, 10 ml im seitlichen Bereich und der verbleibende Teil im Fuß.

Basisbewertung und Nachverfolgung. Die Schmerzbeurteilung erfolgt anhand einer persönlichen Skala von 3 Graden (leicht, mittelschwer und schwer) und die Überwachung des Konsums schmerzstillender Medikamente. Ischämische Läsionen werden wöchentlich von einer in Wundmanagement ausgebildeten Krankenschwester behandelt. Präoperativ und 3, 6 und 12 Monate nach dem Implantat werden CEUS, Läsionsentwicklung und Schmerzbehandlung beurteilt.