Autologa endotelial stamceller (EPC) från perifert blod vid behandling av kritisk extremitetsischemi

Typ av studie. Prospektiv singelcenter inte randomiserat. Syfte med studien. Att bedöma säkerheten, genomförbarheten och effektiviteten av lokal intramuskulär administrering av autologa utvalda CD 133+-celler hos patienter som lider av CLI.

Alla de inskrivna patienterna led av CLI enligt TASC 2-definitionerna och hade inget revaskulariseringsalternativ, baserat på kontrast-CT eller angiografi. Ett detaljerat informerat samtycke, godkänt av vår EC, hade krävts. En ålder som är lägre än 18 år och över 70 år på grund av dålig märgkänslighet för läkemedelssimulering hos äldre personer. Klinisk ostadighet i CLI, såsom kallbrand som kräver kraftig amputation och låg förväntad livslängd, infördes som uteslutningskriterier för förmodad latens av EPCs åtgärd. Allvarlig systemisk sjukdom bedömdes öka risken för märgstimulering. Patienter med allergisk diates, fertil ålder, tidigare EPC-muskulärt implantat, tidigare medicinskt experimentellt protokoll och eventuella intressekonflikter med studien exkluderades.

Patienter: vi registrerar patienter med en historia av Rutherford stadium 4 (vilosmärta) eller 5 (små ischemiska lesioner) PAD. Alla patienter har tidigare (kontrast-CT, MR eller angiografi) vaskulär avbildning exklusive revaskulariseringsalternativ, både endovaskulära och öppna och stött på inskrivnings- och uteslutningskriterierna. Varje patient genomgår rutinmässig fysisk och instrumentell undersökning inklusive elektrokardiogram, lungröntgen och blodprovsanalys. Yngre patienter uppfyllde Buergers sjukdomskriterier, medan andra hade rena aterosklerotiska lesioner.

CEUS Imaging Protocol. Två operatörer (F.C. och A.G., med 20 respektive 3 års erfarenhet) som är blinda för behandling utför kontrastförstärkt UL för alla patienter. Två amerikanska scanners (Philips iU22 (Bothell, WA, USA) med linjär array L9-3-givare och GE Logiq e9 (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) med linjär array L6-9-givare används.

Avbildningsparametrarna är: reducerad sändningseffekt (mekaniskt index <0,06), med cirka 7-10 bilder per sekund och ett fokus långt under målets nivå för att säkerställa ett mer enhetligt tryckfält. Dubbellägespresentation av en gråskalebild sida vid sida med kontrastbilden underlättade realtidsidentifiering av anatomiska strukturer och ROI-val. Bildslingor på cirka 60 sekunder förvärvades. Man försökte ha en enhetlig förstärkning över hela bilden och för att undvika förstärkningsmättnad. TGC (tidsförstärkningskompensation) ställdes in så att en enhetlig svart bild visades före ankomst av kontrast. En injektionsflaska med kontrastmedel (SonoVue BR1; Bracco, Milano, Italien) bereds i en koncentration av cirka 2x108 svavelhexafluoridfyllda mikrobubblor per milliliter, enligt tillverkarens rekommendationer. Före varje injektion återsuspenderas mikrobubblor genom att skaka flaskan. Sondens position registreras för varje patient för att bibehålla samma position under uppföljningen. Kontrastinjektionen består av en intravenös bolus på 4,8 ml kontrastmedel som injiceras i antecubital ven på 2 sekunder följt av en koksaltlösning på 5 ml. Injektionen görs med patienten liggande och efter 10 minuters vila för att undvika träningsrelaterad mikrovaskulär dilatation. Radiologen upprätthåller ett konstant bildplan med hjälp av vävnaden (grundbilden) i avbildningsläget "Kontrast Side/Side".

Bildanalys. Bildslingorna överförs till en persondator för vidare analys. De huvudsakliga bildanalysuppgifterna är: a) identifiering av tibialis anterior artery (TAA), b) val av en representativ region av normal tibialis anterior muskel (TAM) och c) formulering av tidsintensitetskurvor. Två manuellt definierade regioner av intresse (ROI), 2 cm och 4 cm sid-fyrkanter, placeras, respektive, över tibialis anterior muskel utan tecken på artärförgreningar, över tibialis anterior artär och över en liten tibialis artärgren. ROI:erna placeras i samma anatomiska position för varje patient för att undvika oönskade skillnader under uppföljningsundersökningar. En tid/intensitetskurva (TIC) erhålls för varje ROI. Från en analys av CEUS tidsintensitetskurvor beräknar vi regionalt blodflöde (RBF) och volym (RBV). Tidsintensitetskurvor extraheras med hjälp av kommersiell kvantifieringsprogramvara (QontraXt v.3.60, AMID, Rom, Italien). Denna programvara tillåter manuellt val av intresseområde (ROI), mätning av det valda ROI-området och tillhandahåller linjära data för tidsintensitetskurvorna. För ROI i den normala ATM görs ansträngningar för att placera regionen i ett område utan stora fartyg. ATA:s ROI är ett 2 cm kvadratiskt område och ATM ROI är ett 4 cm kvadratiskt område. Tidsintensitetskurvor erhålls genom att beräkna medelintensiteten för pixlar som ingår i ROI vid varje tidpunkt. För varje bildslinga beräknas:

• RBV som består av den totala mängden kontrastmedel inom den valda ROI, under en tidsperiod. På grund av egenskaperna hos amerikanska kontrastmedel återspeglar det mängden blod i en definierad region. Det är direkt relaterat till arean under kurvan (AUC).
• RBF som är i direkt förhållande till perfusion i en given ROI. Den består av kontrastmedieflödet (relaterat till blodflödet) i en vald ROI. Det är relaterat till den genomsnittliga transittiden.

Märgstimulering. Human rekombinant granulocytkolonistimulerande faktor (rhGCSF) administreras subkutant under 4-5 dagar i följd i en dos av 10 µg/kg dagligen, uppdelad i 2 doser. Från och med den tredje dagen av mobiliseringen övervakas CD133+-cellantalet dagligen genom cytofluorimetrisk analys på ett 2 ml prov erhållet från patienternas perifera blod. Det lägsta antalet CD133+-celler som är godtagbart för insamling av leukaferes (LKF) var 10/µl. Patienterna övervakas för eventuella G-CSF-relaterade biverkningar.

Leukaferes samling. En enda LKF-insamling planeras för varje patient som använder en tredje generationens cellseparatorenhet (Spectra Cobe, Lakewood, CO), som behandlar minst 2,5 blodvolymer enligt vårt interna protokoll för stamcellsinsamling. Patienterna övervakas med avseende på blodtryck och hjärtfrekvens under hela insamlingsproceduren. Omedelbart efter LKF tas ett prov från patientens perifera blod för hemocytometrisk analys för att utvärdera trombocytantal och Hb-nivåer. Varje leukaferessamling späds ut med 10 % syracitratdextros (ACD-A) och hålls över natten vid 4°C innan immunomagnetiskt cellval. Ett prov på 2 ml från varje LKF-påse tas för cytofluorimetrisk analys. Fyra timmar efter LKF-samlingen utvärderas koagulationsparametrar, elektrolytnivåer och hemocytometrisk analys.

Immunomagnetiskt cellurval. CD133 immunomagnetiska cellurval utförs dagen efter LKF-insamling med hjälp av Clini-MACS (Miltenyi Biotec)-enheten enligt tillverkarens standardprotokoll. Kortfattat tillsätts CliniMACS CD133-reagens (bildat av superparamagnetiska partiklar sammansatta av järnoxid och dextran konjugerat till murina monoklonala antikroppar) till cellerna för inkubation. Produkten tvättas därefter genom spädning med buffert (CliniMACS PBS-EDTA-buffert kompletterad med 0,5 % humant serumalbumin) och cellpåsen hängs på anordningen för det automatiska urvalet av CD133-märkta celler. Ett prov på 2 ml från den positiva fraktionen tas för cytofluorimetrisk analys.

Kvalitetskontroller. Klonogena analyser. Ett prov taget från den CD133-cellpositiva fraktionen efter varje immunomagnetisk cellselektionsprocedur sås för korttids (14 dagar) klonogena analyser. En standardblandning av metylcellulosa plus rekombinant humant erytropoietin, rh stamcellsfaktor (SCF), rhGM-CSF och rh interleukin-3 (IL-3) används (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada; MACS Media, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Tyskland). Mikrobiella kulturer. Mikrobiella kulturer på immunselektionsavfallspåsen som innehåller den negativa fraktionen utförs för att detektera aeroba-anaeroba bakterier och svampkontamination. Ett prov på 10 ml inokuleras i odlingsmediet (Bact/Alert FA och BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) och inkuberas i 10 dagar vid 37°C.

Cytofluorimetrisk analys. Prover erhållna från perifert blod före mobilisering med G-CSF, vid tidpunkten för leukaferes och efter immunomagnetiskt cellval analyseras med flödescytometri för att utvärdera uttrycket av specifika stamcells- och endotelantigener. Becton Dickinson FACSCanto användes för alla flödescytometriska analyser med en lyse no-wash-teknik, med användning av följande monoklonala antikroppar: anti-CD45 fluorescein isotiocyanat (FITC) (Becton Dickinson, San Jose, CA), anti-CD34 Peridinin-klorofyll-protein komplex (PerCP) (8G12-klon, Becton Dickinson), anti-CD133-fykoerytrin (PE) (AC133-klon, Miltenyi Biotec) och anti-VEGF-R2-allofykocyanin (APC) (Fo-U-system). Helblod behandlas enligt instruktionerna för bestämning av VEGF-R2 (KDR). Varje blodprov överförs till ett 50 ml falkrör och bringas till en total volym av 30 ml genom tillsats av ammoniumfosfatinnehållande lysbuffert (Becton Dickinson). Efter en lysperiod på 5 minuter centrifugeras PB vid 500 g under 5 minuter och tvättas två gånger med PBS innehållande 0,5 % bovint serumalbumin (BSA). 100 µl av varje prov överförs sedan till ett BD-rör för cytometrisk analys och inkuberas i 15 minuter med 1 µg/105 celler IgG för att blockera alla ospecifika platser. 50 µl av det IgG-blockerade provet inkuberas med 20 µl anti-VEGF-R2-antikropp under 30 minuter vid 4°C i mörker och tvättas sedan två gånger med PBS. Vid slutet av det sista tvättsteget tillsätts 10 µl av var och en av de andra antikropparna (anti-CD45, anti-CD34, anti-CD133) och inkuberas i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker. Varje prov hämtas med BD FACSCanto som spelar in 100 000 händelser inuti lymfocyten plus monocytporten. Datafiler analyseras med programvaran FACS Diva 6.1. Viabiliteten utvärderas med användning av 7-amino-aktinomycin D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Ett prov för Hill och EBM2 klonogena analyser tas från patientens perifera blod före och efter mobilisering (vid tidpunkten för LKF-uppsamling).

Implantatprocedur. Efter lokoregional anestesi och kutan desinfektion under knäet administreras 45-48 ml autolog CD133+ saltlösningssuspension intramuskulärt med 1 ml djup injektion genom 18G nål. Injektionerna fördelades så: 10 ml i den främre delen av benet, 10 ml i den ytliga bakre delen, 10 ml i den djupa bakre delen, 10 ml i den laterala delen av benet och den återstående delen i foten.

Baslinjebedömning och uppföljning. Smärtbedömning görs med en personlig skala på 3 grader (lindrig, måttlig och svår) och de smärtstillande drogerna använder övervakning. Ischemiska lesioner behandlas varje vecka av en skicklig sårvårdsskötare. Preoperativt och 3, 6 och 12 månader efter implantatet bedöms CEUS, lesionsutveckling och smärtbehandling.