重症虚血肢の治療における末梢血からの自己内皮前駆細胞 (EPC)

研究の種類。 ランダム化されていない単一センター候補。 研究の目的。 CLI患者における選択された自己CD133+細胞の局所筋肉内投与の安全性、実現可能性および有効性を評価する。

登録された患者は全員、TASC 2 の定義によれば CLI を患っており、造影 CT または血管造影画像に基づいて血行再建の選択肢はありませんでした。 EC によって承認された詳細なインフォームドコンセントが必要でした。 高齢者の薬物シミュレーションに対する骨髄の反応性が低いため、18 歳未満および 70 歳以上の年齢 大切断を必要とする壊疽などの CLI の臨床的不安定性および余命の短さは、推定潜伏期間の除外基準として導入されました。 EPC のアクション。 重度の全身疾患は骨髄刺激のリスクを高めると判断されました。 アレルギー素因、出産年齢、以前の EPC 筋肉インプラント、以前の医療実験プロトコル、および研究と利益相反のある患者は除外されました。

患者：ラザフォードステージ4（安静時疼痛）または5（小さな虚血性病変）PADの病歴を持つ患者を登録します。 すべての患者は、血管内および開放の両方の血行再建オプションを除く血管画像診断（造影CT、MR、または血管造影）を受けており、登録基準および除外基準に該当した。 すべての患者は、心電図、胸部X線、血液サンプル分析などの定期的な身体検査および機器検査を受けます。 若い患者はバージャー病の基準を満たしていましたが、他の患者は純粋なアテローム性動脈硬化性病変を持っていました。

CEUS イメージング プロトコル。 治療を知らされていない 2 人のオペレーター (F.C. と A.G.、それぞれ 20 年と 3 年の経験を持つ) が、すべての患者に対して造影 US を実行します。 2 台の US スキャナ (リニア アレイ L9-3 トランスデューサを備えた Philips iU22 (ワシントン州ボセル、米国) とリニア アレイ L6-9 トランスデューサを備えた GE Logiq e9 (GE Healthcare、米国ウィスコンシン州ミルウォーキー) を使用します。

イメージング パラメータは次のとおりです。送信電力の低減 (機械指数 <0.06)、 1 秒あたり約 7 ～ 10 フレームで焦点を合わせ、より均一な圧力フィールドを確保するためにターゲットのレベルよりかなり下に焦点を合わせます。 グレースケール画像とコントラスト画像を並べて表示するデュアルモード表示により、解剖学的構造のリアルタイム識別と ROI 選択が容易になりました。 約 60 秒の画像ループが取得されました。 画像全体でゲインを均一にし、ゲインの飽和を避けるために努力が払われました。 TGC (時間利得補償) は、コントラストが到達する前に均一な黒の画像が表示されるように設定されました。 造影剤（SonoVue BR1; Bracco、ミラノ、イタリア）のバイアルは、製造業者の推奨に従って、1 ミリリットルあたり約 2x108 個の六フッ化硫黄充填マイクロバブルの濃度で準備されます。 各注入の前に、バイアルを振ってマイクロバブルを再懸濁します。 追跡中に同じ位置を維持するために、プローブの位置が患者ごとに記録されます。 造影剤注入は、肘前静脈に 2 秒間で 4.8 ml の造影剤を静脈内ボーラス注入し、その後 5 ml の生理食塩水をフラッシュすることで構成されます。 注射は、運動に関連した微小血管の拡張を避けるために、患者を仰向けにし、10分間休んだ後に行われます。 放射線科医は、「コントラストサイド/サイド」イメージングモードの組織 (基本画像) を利用して、一定の画像面を維持します。

画像解析。 画像ループは、さらなる分析のためにパーソナルコンピュータに転送されます。 主な画像解析タスクは、a) 前脛骨動脈 (TAA) 領域の特定、b) 正常な前脛骨筋 (TAM) の代表領域の選択、および c) 時間強度曲線の定式化です。 手動で定義した 2 cm および 4 cm の正方形の 2 つの関心領域 (ROI) を、それぞれ、動脈分岐の形跡がない前脛骨筋上、前脛骨動脈上、および小さな脛骨筋動脈分岐上に配置します。 ROI は、追跡検査中に望ましくない差異が生じるのを避けるために、各患者の同じ解剖学的位置に配置されます。 時間/強度曲線 (TIC) が ROI ごとに取得されます。 CEUS の時間強度曲線の分析から、局所血流 (RBF) と体積 (RBV) を計算します。 時間-強度曲線は、市販の定量化ソフトウェア (QontraXt v.3.60、 AMID、ローマ、イタリア）。 このソフトウェアは、手動による関心領域 (ROI) の選択、選択された ROI エリアの測定を可能にし、時間強度曲線の線形データを提供します。 通常の ATM の ROI では、大きな血管のないエリアに領域を配置するように努めます。 ATA の ROI は 2 cm 四方の領域で、ATM ROI は 4 cm 四方の領域です。 時間強度曲線は、各時点での ROI 内に含まれるピクセルの平均強度を計算することによって取得されます。 画像ごとにループが計算されます。

• 一定期間における、選択した ROI 内の造影剤の総量からなる RBV。 米国の造影剤の特性により、造影剤は定義された領域の血液量を反映します。 これは、曲線下面積 (AUC) に直接関係します。
• 特定の ROI における灌流に対する正比例の RBF。 これは、選択された ROI 内の造影剤の流れ (血流に関連する) で構成されます。 これは平均通過時間に関係します。

骨髄刺激。 ヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子 (rhGCSF) を、1 日あたり 10 μg/kg の用量で 2 回に分けて 4 ～ 5 日間連続して皮下投与します。 動員の３日目から始めて、患者の末梢血から得た２ｍｌのサンプルに対する細胞蛍光分析によってＣＤ１３３＋細胞数を毎日監視する。 白血球分離（LKF）収集に許容される最小 CD133+ 細胞数は 10/μl でした。 患者は、G-CSF 関連の副作用がないか監視されます。

白血球除去コレクション。 第 3 世代の細胞分離装置 (コロラド州レイクウッドの Spectra Cobe) を使用して、患者ごとに 1 回の LKF 採取が計画されており、幹細胞採取の社内プロトコールに従って少なくとも 2.5 血液量が処理されます。 採取手順全体を通じて、患者の血圧と心拍数が監視されます。 LKFの直後、患者の末梢血からサンプルが採取され、血小板数とHbレベルを評価する血球計算分析が行われます。 各白血球除去コレクションは 10% 酸性クエン酸デキストロース (ACD-A) で希釈され、免疫磁気細胞の選択前に 4℃ で一晩維持されます。 各 LKF バッグから 2 ml のサンプルを細胞蛍光分析用に採取します。 LKF 収集の 4 時間後に、凝固パラメーター、電解質レベル、および血球計算分析が評価されます。

免疫磁性細胞の選択。 ＣＤ１３３免疫磁性細胞の選択は、ＬＫＦ収集の翌日に、Ｃｌｉｎｉ－ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）装置を製造業者の標準プロトコールに従って使用して行う。 簡単に説明すると、CliniMACS CD133 試薬 (マウスモノクローナル抗体に結合した酸化鉄とデキストランで構成される超常磁性粒子によって形成される) をインキュベーションのために細胞に添加します。 続いて、生成物を緩衝液（0.5％ヒト血清アルブミンを補充したCliniMACS PBS-EDTA緩衝液）で希釈して洗浄し、細胞バッグをCD133標識細胞の自動選択用の装置に掛けます。 細胞蛍光分析のために陽性画分から 2 ml のサンプルを採取します。

品質管理。 クローン原性アッセイ。 各免疫磁性細胞選択手順の後に CD133 細胞陽性画分から採取したサンプルを、短期間 (14 日間) クローン原性アッセイ用に播種します。 メチルセルロースと組換えヒトエリスロポエチン、rh 幹細胞因子 (SCF)、rhGM-CSF、および rh インターロイキン-3 (IL-3) の標準混合物が使用されます (Stem Cell Technologies、バンクーバー、BC、カナダ; MACS Media、Miltenyi Biotec) GmbH、ベルギッシュ グラッドバッハ、ドイツ）。 微生物培養。 陰性画分を含む免疫選択廃棄物バッグ上で微生物培養を行い、好気性嫌気性細菌および真菌汚染を検出します。 10mlのサンプルを培地(Bact/Alert FAおよびBacT/Alert FN、Organon Teknika Corp.、ダーラム、ノースカロライナ州)に接種し、37℃で10日間インキュベートする。

細胞蛍光分析。 G-CSF による動員前、白血球除去時、免疫磁性細胞選択後に末梢血から採取したサンプルをフローサイトメトリーで分析し、特定の幹細胞および内皮抗原の発現を評価します。 Becton Dickinson FACSCanto は、次のモノクローナル抗体を使用した、洗浄不要の溶解技術によるすべてのフローサイトメトリー アッセイに採用されました: 抗 CD45 フルオレセイン イソチオシアネート (FITC) (Becton Dickinson、カリフォルニア州サンノゼ)、抗 CD34 ペリジニン クロロフィル タンパク質複合体（PerCP）（8G12 クローン、Becton Dickinson）、抗 CD133 フィコエリトリン（PE）（AC133 クローン、Miltenyi Biotec）、および抗 VEGF-R2 アロフィコシアニン（APC）（R&D Systems）。 全血は、VEGF-R2 (KDR) 測定の指示に従って処理されます。 各血液サンプルを５０ｍｌファルコンチューブに移し、リン酸アンモニウム含有溶解緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を加えて総容量を３０ｍｌにする。 ５分間の溶解時間の後、ＰＢを５００ｇで５分間遠心分離し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで２回洗浄する。 次に、各サンプル 100 μl を血球計算分析用の BD チューブに移し、すべての非特異的部位をブロックするために 1 μg/105 細胞 IgG とともに 15 分間インキュベートします。 50μlのIgGブロックサンプルを20μlの抗VEGF-R2抗体とともに暗所、4℃で30分間インキュベートし、その後PBSで2回洗浄する。 最後の洗浄ステップの終了時に、他の抗体 (抗 CD45、抗 CD34、抗 CD133) をそれぞれ 10 μl 加え、暗所、室温で 10 分間インキュベートします。 各サンプルは BD FACSCanto 記録 100.000 で取得されます。 リンパ球と単球ゲート内のイベント。 データファイルはFACS Diva 6.1ソフトウェアで分析されます。 生存率は、7-アミノ-アクチノマイシン D (7-AAD) (Molecular Probes、オレゴン州ユージーン) を使用して評価されます。 Hill および EBM2 クローン原性アッセイ用のサンプルは、動員の前後 (LKF 採取時) に患者の末梢血から採取されます。

インプラントの手順。 局所麻酔および膝下の皮膚消毒後、45〜48mlの自己CD133+生理食塩水懸濁液を、18G針を介して1mlの深部注射により筋肉内投与する。 注射は、脚の前部区画に１０ｍｌ、表面後部区画に１０ｍｌ、深部後区画に１０ｍｌ、外側区画に１０ｍｌ、および足の残りの部分に割り当てた。

ベースライン評価とフォローアップ。 痛みの評価は 3 段階（軽度、中等度、重度）の個人スケールで行われ、鎮痛剤の使用状況はモニタリングされます。 虚血性病変は、創傷管理に熟練した看護師によって毎週治療されます。 術前とインプラント後 3、6、12 か月後に、CEUS、病変の進展、および疼痛管理が評価されます。