Аутологичные эндотелиальные клетки-предшественники (ЭПК) из периферической крови при лечении критической ишемии конечностей

Тип исследования. Проспективный единый центр, не рандомизированный. Цель исследования. Оценить безопасность, целесообразность и эффективность местного внутримышечного введения аутологичных селективных клеток CD 133+ у пациентов с КИНК.

Все включенные в исследование пациенты страдали CLI в соответствии с определениями TASC 2 и не имели возможности реваскуляризации на основании контрастной КТ или ангиографии. Требовалось подробное информированное согласие, одобренное нашим ЕС. Возраст моложе 18 лет и старше 70 лет из-за плохой реакции костного мозга на симуляцию лекарств у пожилых людей. Клиническая неустойчивость CLI, такая как гангрена, требующая обширной ампутации, и плохая продолжительность жизни были введены в качестве критериев исключения предполагаемой латентности действие ЭПК. Считалось, что тяжелые системные заболевания повышают риск стимуляции костного мозга. Пациенты с аллергическим диатезом, в детородном возрасте, с мышечным имплантатом в прошлом, предшествующим протоколом медицинских экспериментов и любым конфликтом интересов с исследованием были исключены.

Пациенты: мы регистрируем пациентов с 4-й (боль в покое) или 5-й (небольшие ишемические очаги) ЗПА в анамнезе по Резерфорду. Все пациенты ранее (контрастная КТ, МРТ или ангиография) выполняли визуализацию сосудов, за исключением вариантов реваскуляризации, как эндоваскулярной, так и открытой, и соответствовали критериям включения и исключения. Каждому пациенту проводится плановое физикальное и инструментальное обследование, включающее электрокардиограмму, рентгенографию органов грудной клетки и анализ крови. Молодые пациенты соответствовали критериям болезни Бюргера, в то время как другие имели чисто атеросклеротические поражения.

Протокол визуализации CEUS. Два оператора (Ф.К. и А.Г., с 20-летним и 3-летним опытом соответственно), которые не знают о лечении, выполняют УЗИ с контрастным усилением для всех пациентов. Используются два ультразвуковых сканера (Philips iU22 (Ботелл, Вашингтон, США) с датчиком линейной матрицы L9-3 и GE Logiq e9 (GE Healthcare, Милуоки, Висконсин, США) с датчиком линейной матрицы L6-9).

Параметры изображения: пониженная мощность передачи (механический индекс <0,06), со скоростью примерно 7-10 кадров в секунду и одним фокусом значительно ниже уровня цели, чтобы обеспечить более равномерное поле давления. Двухрежимное представление изображения в градациях серого рядом с контрастным изображением облегчает идентификацию анатомических структур в реальном времени и выбор области интереса. Были получены петли изображений продолжительностью около 60 секунд. Были предприняты усилия, чтобы получить равномерное усиление по всему изображению и избежать насыщения усиления. TGC (компенсация усиления по времени) была установлена ​​таким образом, чтобы до прихода контраста показывалось однородное черное изображение. Флакон с контрастным веществом (SonoVue BR1; Bracco, Милан, Италия) готовят в концентрации около 2×108 микропузырьков, наполненных гексафторидом серы, на миллилитр в соответствии с рекомендациями производителя. Перед каждой инъекцией микропузырьки ресуспендируют путем встряхивания флакона. Положение датчика записывается для каждого пациента, чтобы сохранить то же положение во время последующего наблюдения. Инъекция контраста состоит из внутривенного болюса 4,8 мл контрастного вещества, вводимого в антекубитальную вену за 2 секунды с последующим введением 5 мл физиологического раствора. Инъекцию делают в положении пациента на спине и после 10-минутного отдыха, чтобы избежать дилатации микрососудов, связанной с физической нагрузкой. Рентгенолог поддерживает постоянную плоскость изображения с помощью ткани (фундаментального изображения) в режиме визуализации «Контрастная сторона/сторона».

Анализ изображения. Циклы изображения передаются на персональный компьютер для дальнейшего анализа. Основными задачами анализа изображения являются: а) идентификация области передней большеберцовой артерии (ПБА), б) выбор репрезентативной области нормальной передней большеберцовой мышцы (ПМА) и в) построение кривых время-интенсивность. Две определяемые вручную области интереса (ROI), квадраты со сторонами 2 см и 4 см, помещаются, соответственно, над передней большеберцовой мышцей без признаков артериальных ветвей, над передней большеберцовой артерией и над небольшой ветвью большеберцовой артерии. ROI размещаются в одном и том же анатомическом положении для каждого пациента, чтобы избежать нежелательных различий во время последующих исследований. Кривая время/интенсивность (TIC) получается для каждой ROI. На основе анализа кривых время-интенсивность CEUS мы рассчитываем региональный кровоток (RBF) и объем (RBV). Кривые временной интенсивности извлекаются с использованием коммерческого программного обеспечения для количественной оценки (QontraXt v.3.60, АМИД, Рим, Италия). Это программное обеспечение позволяет вручную выбирать область интереса (ROI), измерять выбранную область ROI и предоставляет линейные данные для кривых время-интенсивность. Для ROI в обычном банкомате делается попытка поместить область в зону без крупных сосудов. ROI ATA представляет собой квадратную площадь 2 см, а ROI ATM — 4 квадратных см. Кривые временной интенсивности получают путем вычисления средней интенсивности пикселей, входящих в область интереса, в каждый момент времени. Для каждого цикла изображения рассчитываются:

• RBV, который состоит из общего количества контрастного вещества в выбранной области интереса за определенный период времени. Из-за характеристик контрастных веществ для УЗИ он отражает количество крови в определенной области. Это напрямую связано с площадью под кривой (AUC).
• RBF, который прямо пропорционален перфузии в данной области интереса. Он состоит в потоке контрастного вещества (связанном с кровотоком) в выбранной области интереса. Это связано со средним временем прохождения.

Стимуляция костного мозга. Рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (rhGCSF) вводят подкожно в течение 4-5 дней подряд в дозе 10 мкг/кг в сутки, разделенной на 2 приема. Начиная с третьего дня мобилизации ежедневно контролируют количество клеток CD133+ с помощью цитофлуориметрического анализа в образце 2 мл, полученном из периферической крови пациентов. Минимальное количество клеток CD133+, приемлемое для сбора с помощью лейкафереза ​​(LKF), составляло 10/мкл. Пациенты находятся под наблюдением на предмет любых побочных эффектов, связанных с Г-КСФ.

Сбор лейкафереза. Для каждого пациента планируется одиночный сбор LKF с использованием устройства для сепарации клеток третьего поколения (Spectra Cobe, Lakewood, CO), обрабатывающего не менее 2,5 объемов крови в соответствии с нашим внутренним протоколом сбора стволовых клеток. У пациентов контролируют кровяное давление и частоту сердечных сокращений в течение всей процедуры сбора. Сразу после ЛКФ у пациента берут образец периферической крови для гемоцитометрического анализа для оценки количества тромбоцитов и уровня гемоглобина. Каждую коллекцию лейкафереза ​​разбавляют 10% раствором кислого цитрата декстрозы (ACD-A) и выдерживают в течение ночи при 4°C перед иммуномагнитной селекцией клеток. Из каждого мешка LKF берут образец объемом 2 мл для цитофлуориметрического анализа. Через четыре часа после сбора LKF оценивают параметры коагуляции, уровни электролитов и гемоцитометрический анализ.

Иммуномагнитная селекция клеток. Селекцию иммуномагнитных клеток CD133 проводят на следующий день после сбора LKF с использованием устройства Clini-MACS (Miltenyi Biotec) в соответствии со стандартным протоколом производителя. Вкратце, к клеткам для инкубации добавляют реагент CliniMACS CD133 (образованный суперпарамагнитными частицами, состоящими из оксида железа и декстрана, конъюгированных с мышиными моноклональными антителами). Затем продукт промывают путем разбавления буфером (буфер CliniMACS PBS-EDTA с добавлением 0,5% сывороточного альбумина человека) и пакет с клетками подвешивают к устройству для автоматического отбора меченых CD133 клеток. Из положительной фракции берут 2 мл пробы для цитофлуориметрического анализа.

Контроль качества. Клоногенные анализы. Образец, взятый из положительной фракции клеток CD133 после каждой процедуры иммуномагнитной селекции клеток, засевают для краткосрочных (14 дней) клоногенных анализов. Используется стандартная смесь метилцеллюлозы плюс рекомбинантный человеческий эритропоэтин, резус-фактор стволовых клеток (SCF), rhGM-CSF и резус-интерлейкин-3 (IL-3) (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада; MACS Media, Miltenyi Biotec). GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия). Микробные культуры. Для выявления аэробно-анаэробных бактерий и грибковой контаминации проводят посев микробов на пакет отходов иммуноселекции, содержащий негативную фракцию. Образец объемом 10 мл инокулируют в культуральную среду (Bact/Alert FA и BacT/Alert FN, Organon Teknika Corp., Durham, NC) и инкубируют в течение 10 дней при 37°C.

Цитофлуориметрический анализ. Образцы, полученные из периферической крови до мобилизации с помощью G-CSF, во время лейкафереза ​​и после иммуномагнитной селекции клеток, анализируют с помощью проточной цитометрии для оценки экспрессии специфических антигенов стволовых клеток и эндотелия. Becton Dickinson FACSCanto использовали для всех проточных цитометрических анализов с методом лизиса без отмывки, используя следующие моноклональные антитела: анти-CD45 флуоресцеинизотиоцианат (FITC) (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния), анти-CD34 перидинин-хлорофилл-белок. комплекс (PerCP) (клон 8G12, Becton Dickinson), фикоэритрин (PE) против CD133 (клон AC133, Miltenyi Biotec) и аллофикоцианин против VEGF-R2 (APC) (R&D systems). Цельную кровь обрабатывают в соответствии с инструкциями по определению VEGF-R2 (KDR). Каждый образец крови переносят в пробирку Falcon объемом 50 мл и доводят до общего объема 30 мл путем добавления буфера для лизиса, содержащего фосфат аммония (Becton Dickinson). После периода лизиса в течение 5 минут PB центрифугируют при 500 g в течение 5 минут и дважды промывают PBS, содержащим 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Затем 100 мкл каждого образца переносят в пробирку BD для цитометрического анализа и инкубируют в течение 15 минут с 1 мкг/105 клеток IgG для блокирования всех неспецифических участков. 50 мкл образца, блокированного IgG, инкубируют с 20 мкл антитела против VEGF-R2 в течение 30 минут при 4°С в темноте, а затем дважды промывают PBS. В конце последней стадии промывки добавляют по 10 мкл каждого из других антител (анти-CD45, анти-CD34, анти-CD133) и инкубируют 10 минут при комнатной температуре в темноте. Каждый образец получен с помощью BD FACSCanto с записью 100 000 события внутри ворот лимфоцитов и моноцитов. Файлы данных анализируются с помощью программного обеспечения FACS Diva 6.1. Жизнеспособность оценивают с использованием 7-аминоактиномицина D (7-AAD) (Molecular Probes, Eugene, OR). Образец для клоногенных анализов Hill и EBM2 берут из периферической крови пациента до и после мобилизации (во время сбора LKF).

Процедура имплантации. После местно-регионарной анестезии и дезинфекции кожи ниже колена внутримышечно вводят 45-48 мл аутологичной суспензии CD133+ в физиологическом растворе с глубокой инъекцией 1 мл через иглу 18G. Инъекции распределяли так: 10 мл в передний отдел голени, 10 мл в поверхностный задний отдел, 10 мл в глубокий задний отдел, 10 мл в боковой отдел и оставшуюся часть в стопу.

Базовая оценка и последующее наблюдение. Оценка боли проводится по персональной шкале из 3-х степеней (легкая, умеренная и сильная) и мониторинг применения обезболивающих препаратов. Ишемические поражения еженедельно обрабатываются квалифицированной медсестрой по лечению ран. До операции и через 3, 6 и 12 месяцев после имплантации оценивают CEUS, эволюцию поражения и обезболивание.