Photodynamische Therapie mit roten LEDs in Mikroorganismen im Zusammenhang mit Mundgeruch (halitosis)

Die Studie wird den regulatorischen Normen der Forschung am Menschen mit positiver Stellungnahme der Forschungsethikkommission der Universität Nove de Julho folgen, und die Verantwortlichen der Teilnehmer werden die Einverständniserklärung kostenlos nach Klärung zur Genehmigung der Teilnahme an der Forschung unterzeichnen , gemäß der Resolution 466/12 des Nationalen Gesundheitsrates.

Art der Studie: Eine kontrollierte, quantitative klinische Querschnittsstudie. Hypothese Nullhypothese: Es gibt keine Veränderung des Mundgeruchs nach Anwendung der photodynamischen Therapie unter Verwendung von blauem Farbstoff und roter LED.

Es gibt keine mikrobiologische Veränderung nach antimikrobieller photodynamischer Therapie.

Experimentelle Hypothese: Es gibt eine Abnahme des Mundgeruchs nach der Anwendung der photodynamischen Therapie unter Verwendung von blauem Farbstoff und roter LED, verbunden oder nicht mit dem Zungenschaber.

Es gibt eine mikrobiologische Veränderung nach einer antimikrobiellen photodynamischen Therapie.

• Forschungssubjekte Für diese Studie werden junge Erwachsene beiderlei Geschlechts ausgewertet, die regelmäßig in der Zahnklinik der Universität Nove de Julho – São Paulo eingeschrieben sind.

Einschlusskriterien Eingeschlossen in diese Studie sind junge Erwachsene im Alter zwischen 18 und 25 Jahren mit einer Einverständniserklärung und Genehmigung für die Diagnose und Behandlung von Mundgeruch.

Junge Erwachsene mit diagnostiziertem Mundgeruch mit Oralchroma S2H ≥ 112 ppb und/oder CH3SH ≥ 26.

Die ausgewählten Fächer werden in 3 Gruppen eingeteilt. Für jede Gruppe findet 1 Sitzung statt. Alle Proben der Probanden werden vor und nach der Behandlung einer mikrobiologischen Analyse und Bewertung mit Oral ChromaTM unterzogen, gefolgt von Kontrollen über 7, 14 und 30 Tage.

Mikrobiologische Analyse

Proben der lingualen Plaque werden mit einem sterilen Tupfer entnommen, der mit einer einzigartigen Bewegung und leichtem Druck über die Oberfläche des Zungenrückens geführt wird. Die Proben werden in sterilen Röhrchen deponiert, die identifiziert und bis zur Analyse bei -80 ° C gelagert werden. Nach dem Auftauen werden die Proben eine Minute lang gevortext. Zur Extraktion der Bakterien-DNA werden die Proben 10 Minuten gekocht und anschließend 10 Minuten bei 10.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Mikroröhrchen gegeben, das 100 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) enthält, gefolgt von einer Ethanolfällung. Die gereinigte DNA wird in TE-Puffer resuspendiert. Die Konzentrationen von P. gingivalis, T. forsythia und T. denticola werden durch quantitative PCR analysiert. Die quantitative Analyse wird mittels Echtzeit-PCR mit dem Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) und fluoreszenzdetektierten Produkten mit dem Quantimix Easy SYG Kit (Biotools, Madrid, Spanien) durchgeführt. nach dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll. Zu der Reaktion werden 10 ul SYBR Green 0,5 ul DNA-Matrize, 200 mM von jedem Primer (P. gingivalis CATAGATATCACGAGGAACTCCGA TT und AAACTGTTAGCAACTACCGATGTGG; T. forsythia GGGTGAGTAACGCGTATGTAACCT und ACCCATCCGCAACCAATAAA, T. denticola CGTTCCTGGGCCTTGTACA und TAGCGACTTCAGGTACCCTCG; Universelle Bakterien CCATGAAGTCGGAATCGCTAG und GCTTGACGGGCGGTGT) in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Für die Standardkurve werden Reaktionen, die Matrizen-DNA enthalten, 2 bis 2 x 105 Kopien des analysierten Gens (16S-rRNA) unter Verwendung von pTOPO-Plasmiden durchgeführt, in die die 16S-Gene der 14 verschiedenen Organismen kloniert werden. Als Negativkontrolle wird anstelle des DNA-Templates steriles milliQ-Wasser hinzugefügt. Reaktionen auf 16S-rRNA werden mit anfänglicher Denaturierung bei 95°C für 2 Minuten, gefolgt von 36 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten und abschließender Verlängerung bei 72°C durchgeführt 10 Minuten 46. Die Fluoreszenz wird nach jedem Zyklus detektiert und mit der Step One Plus Real-Time PCR System Software (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) aufgezeichnet. Um die Spezifität der durch Fluoreszenz nachgewiesenen Produkte zu gewährleisten und den Nachweis von Primer-Dimeren zu vermeiden, wird der Nachweis bis zu einem Grad unterhalb der Dissoziationstemperatur der Amplikons durchgeführt. Alle Proben werden zweifach analysiert und jede Verdünnung der Plasmide mit der Standardkurve dreifach. Der Zweck der mikrobiologischen Bewertung besteht darin, die Wirksamkeit der photodynamischen Therapie zur Behandlung von Mundgeruch zu verifizieren und die klinische Bewertung zu ergänzen.

Beurteilung des Grads an Mundgeruch Die Luftentnahme folgt der manuellen OralChromaTM-Anweisung, in der der Teilnehmer angewiesen wird, 1 Minute lang eine Mundspülung mit Cystein (10 mM) herzustellen, um den CSV-Ursprung zu unterscheiden, und 1 Minute lang den Mund geschlossen zu halten. Eine herstellereigene Spritze zum Sammeln von Mundluft wird mit vollständig eingeführtem Kolben in den Mund des Patienten eingeführt. Der Patient schließt den Mund, atmet durch die Nase und wartet 1 Minute mit geschlossenem Mund. Sie werden gebeten, die Spitze der Spritze nicht mit der Zunge zu berühren. Der Kolben wird herausgezogen, entleert erneut Luft aus der Spritze in den Mund des Patienten und zieht den Kolben erneut, um die Spritze mit der Atemprobe zu füllen. Reinigen Sie die Spitze der Spritze, um Feuchtigkeit aus dem Speichel zu entfernen, setzen Sie die Gasinjektionsnadel in die Spritze, stellen Sie den Kolben auf 0,5 ml ein. Es wird mit einem Handgriff in die Gerätetür eingespritzt.

OralChromaTM ermöglicht die Erfassung von Gaskonzentrationswerten durch Messung der CSV-Schwellenwerte (von 0 bis 1000 ppb), sehr genau nach 8 Minuten.

Die Ergebnisse werden auf dem Gerät selbst gespeichert und können jederzeit zum Vergleich vor und nach der Behandlung abgerufen und eingesehen werden.

Aus der Analyse der vom System erfassten CSV:

• Sulfid: stammt hauptsächlich von Bakterien auf dem Zungenrücken. Werte über 112 ppb sind Indikatoren für Mundgeruch.
• Methylmercaptan: überwiegend höher in den Parodontaltaschen. Werte bis 26 ppb gelten als normal. Parodontitis führt typischerweise zu einem hohen Verhältnis von Methylmercaptan / Sulfhydrid (> 3: 1)
• Dimethylsulfid: beide können parodontalen Ursprungs oder systemischen (intestinalen, hepatischen, pulmonalen) Ursprungs sein. Es kann auch vorübergehend durch die Einnahme bestimmter Nahrungsmittel und Getränke verursacht werden. Die Wahrnehmungsschwelle von Dimethylsulfid ist mit 8 ppb am niedrigsten.

Um Änderungen der Halimetrie zu vermeiden, wird die Untersuchung morgens durchgeführt und die Teilnehmer werden angewiesen, die folgenden Richtlinien zu befolgen: 48 Stunden vor der Bewertung vermeiden Sie die Einnahme von Lebensmitteln mit Knoblauch, Zwiebeln und starken Gewürzen, Alkoholkonsum und die Verwendung von oralen Antiseptika. Am Tag der Auswertung können Sie morgens bis 2 Stunden vor der Untersuchung essen, auf Kaffee, Bonbons, Kaugummi, Mundhygieneprodukte und parfümiertes Personal (Aftershave, Deodorant, Parfum, Cremes und/oder Tonic) verzichten und das Bürsten wird nur mit Wasser sein.

Für die photodynamische Therapie wird ein für dieses Projekt entwickeltes Gerät mit Emission einer roten LED (660 nm) und einer Spitze mit einem Durchmesser von 2,84 cm² verwendet.

Zum Zeitpunkt der Anwendung der aPDT sind nur der zu behandelnde Freiwillige und der verantwortliche Fachmann anwesend, die beide eine spezielle Augenschutzbrille tragen. Die aktive Spitze des Lasers wird mit durchsichtigem Einwegkunststoff (PVC) beschichtet (Vermeidung von Kreuzkontamination und Hygiene) und der Fachmann wird ordnungsgemäß gekleidet.

Eine Sitzung der Chimiolux® photosensibilisierenden aPDT wird in einer Konzentration von 0,005 % (165 μm) durchgeführt, die ausreichend aufgetragen wird, um das mittlere Drittel und den hinteren Teil der Zunge für 5 Minuten zur Inkubation zu bedecken, der Überschuss wird mit einem Saugnapf entfernt um die nasse Oberfläche mit dem Photosensibilisator selbst ohne die Verwendung von Wasser zu erhalten. Vier Punkte werden mit einem Abstand von 1 cm zwischen den Punkten bestrahlt, wobei der Streuhof und die Wirksamkeit der aPDT berücksichtigt werden (Abbildung 5). Basierend auf früheren Studien, die mit der aPDT zur Behandlung von Mundgeruch durchgeführt wurden, wird das Gerät zuvor mit einer Wellenlänge von 660 nm mit einer Energie von 72 J und einer Leistung von 800 mW für die Gruppen 1 und 3 kalibriert, die für 90 Sekunden pro Punkt bestrahlt werden. Kriechen von 282mW/cm².

Organisation und statistische Verarbeitung von Daten

Die Daten werden tabelliert und im Programm Bioestat 5.0 behandelt. Die deskriptive Statistik der Daten wird durchgeführt. Für die Auswertung der Assoziation kategorialer Variablen werden der Chi-Quadrat-Test und der exakte Fisher-Test verwendet, um die Mittelwerte zu vergleichen, werden der Student-t-Test und die Varianzanalyse (ANOVA) verwendet und um die Korrelation zwischen den kontinuierlichen Variablen zu analysieren wendete den Test der Pearson-Korrelation an. Bei der Analyse der experimentellen Unterschiede in jeder Gruppe wird der Wilcoxon-Test verwendet. Für alle Analysen gilt ein Signifikanzniveau von 95 % (S