Bioenergética y Metabolismo Proteico en la Esclerosis Lateral Amiotrófica Esporádica (Fibro-ALS)

Los investigadores estudiarán fibroblastos derivados de pacientes con ELA esporádica.

Se recogerán parámetros clínicos como sexo, edad, edad de inicio, presentación clínica, parámetros electrofisiológicos, respiratorios, tratamientos.

Los fibroblastos derivados de pacientes y controles se amplificarán y cultivarán a partir de biopsias de piel.

Los cultivos de células de fibroblastos primarios se derivarán de biopsias de piel obtenidas de sujetos de control y de los pacientes después de obtener el consentimiento por escrito. Se realizarán amplificaciones, del paso 1 al 6, dejando tiempo para la criopreservación celular de 10 muestras por línea celular. Todos los experimentos se realizarán en células con números de pases similares, que van de 6 a 25, para evitar artefactos debido a la senescencia.

El crecimiento celular de cada línea se monitoreará con el sistema IncuCyte ZOOM® (Essen Biosciences), un pórtico de microscopio que reside en una incubadora de células y un disco duro controlador externo en red que recopila y procesa datos de imágenes. El crecimiento celular se calculará automáticamente en cada punto de tiempo utilizando la densidad celular relativa (proporción del área ocupada al área total de las regiones adquiridas).

Los parámetros respiratorios de los fibroblastos serán monitoreados con precisión con un oxímetro de alta resolución (OROBOROS). Se medirá la actividad enzimática de cada complejo de la cadena respiratoria mitocondrial mediante espectrometría, y se estudiará el potencial de membrana mitocondrial con microscopía de fluorescencia (sonda TMRM). Los investigadores también estudiarán la dinámica mitocondrial y la arquitectura de la red mitocondrial con microscopía de fluorescencia y microscopía de súper resolución (SRM, Roper). La producción de radicales libres se estimará con sondas sensibles al estrés oxidativo. Finalmente, se realizará un estudio metabolómico (espectrometría de masas QTRAP LC/MS/MS 5500 ABSciex) para caracterizar con precisión los metabolitos en las células y evaluar su perfil metabólico.

Los investigadores buscarán inclusiones de proteínas (filamentos intermedios, TDP43, FUS, ubiquitina) con técnicas de inmunofluorescencia. Se realizarán Western Blots para estudiar el metabolismo de las proteínas. Se analizará la arquitectura del citoesqueleto en SRM y microscopía de fluorescencia, y los investigadores intentarán transfectar fibroblastos para expresar Neurofilamentos y estudiar las consecuencias sobre el citoesqueleto y el metabolismo proteico.

Los investigadores estudiarán la respuesta de las células al estrés (hipoxia SCI-tive Dual, inanición), ya la senescencia (números elevados de pases).