Bio-energetica en eiwitmetabolisme bij sporadische amyotrofische laterale sclerose (Fibro-ALS)

De onderzoekers zullen fibroblasten bestuderen die afkomstig zijn van sporadische ALS-patiënten.

Klinische parameters zullen worden verzameld zoals geslacht, leeftijd, aanvangsleeftijd, klinische presentatie, elektrofysiologische en respiratoire parameters, behandelingen.

Van patiënten en controles afgeleide fibroblasten zullen worden geamplificeerd en gekweekt uit huidbiopten.

Primaire fibroblastcelculturen zullen worden afgeleid van huidbiopten verkregen van controlepersonen en van de patiënten na schriftelijke toestemming. Amplificaties zullen worden uitgevoerd, van passage 1 tot 6, waardoor er tijd is voor celcryopreservatie van 10 monsters per cellijn. Alle experimenten zullen worden uitgevoerd op cellen met vergelijkbare passagenummers, variërend van 6 tot 25, om artefacten als gevolg van senescentie te voorkomen.

De celgroei van elke lijn zal worden gecontroleerd met het IncuCyte ZOOM®-systeem (Essen Biosciences), een microscoopportaal dat zich in een celincubator bevindt, en een externe harde schijf van een netwerkcontroller die beeldgegevens verzamelt en verwerkt. De celgroei wordt op elk tijdstip automatisch berekend met behulp van de relatieve celdichtheid (verhouding van het bezette gebied tot het totale gebied van de verkregen gebieden).

De ademhalingsparameters van de fibroblasten zullen nauwkeurig gevolgd worden met een hoge resolutie oxygraaf (OROBOROS). Enzymatische activiteit van elk complex van de mitochondriale ademhalingsketen zal gemeten worden door middel van spectrometrie, en de mitochondriale membraanpotentiaal zal bestudeerd worden met fluorescentiemicroscopie (TMRM-sonde). De onderzoekers zullen ook de mitochondriale dynamiek en de architectuur van het mitochondriale netwerk bestuderen met fluorescentiemicroscopie en superresolutiemicroscopie (SRM, Roper). De productie van vrije radicalen zal worden geschat met sondes die gevoelig zijn voor oxidatieve stress. Ten slotte zal een metabolomische studie (massaspectrometrie QTRAP LC/MS/MS 5500 ABSciex) worden uitgevoerd om de metabolieten in de cellen precies te karakteriseren en hun metabolisch profiel te beoordelen.

De onderzoekers zullen zoeken naar eiwitinsluitsels (intermediaire filamenten, TDP43, FUS, ubiquitine) met immunofluorescentietechnieken. Western Blots zullen worden uitgevoerd om het eiwitmetabolisme te bestuderen. De architectuur van het cytoskelet zal worden geanalyseerd in SRM en fluorescentiemicroscopie, en de onderzoekers zullen proberen fibroblasten te transfecteren om neurofilamenten tot expressie te brengen en de gevolgen voor het cytoskelet en eiwitmetabolisme te bestuderen.

De onderzoekers zullen de reactie van de cellen op de stress (hypoxie SCI-tive Dual, uithongering) en op senescentie (hoge passage-aantallen) bestuderen.