Bioenergetik och proteinmetabolism i sporadisk amyotrofisk lateralskleros (Fibro-ALS)

Utredarna kommer att studera fibroblaster som härrör från sporadiska ALS-patienter.

Kliniska parametrar kommer att samlas in såsom kön, ålder, debutålder, klinisk presentation, elektrofysiologiska och andningsparametrar, behandlingar.

Fibroblaster härledda från patienter och kontroller kommer att amplifieras och odlas från hudbiopsier.

Primära fibroblastcellkulturer kommer att erhållas från hudbiopsier erhållna från kontrollpersoner och från patienterna efter skriftligt medgivande. Amplifieringar kommer att utföras, från passage 1 till 6, vilket ger tid för cellkryokonservering av 10 prover per cellinje. Alla experiment kommer att utföras på celler med liknande passagenummer, från 6 till 25, för att undvika artefakter på grund av åldrande.

Celltillväxten för varje linje kommer att övervakas med IncuCyte ZOOM®-systemet (Essen Biosciences), en mikroskopportal som finns i en cellinkubator och en nätverksansluten extern styrenhetshårddisk som samlar in och bearbetar bilddata. Celltillväxt beräknas automatiskt vid varje tidpunkt med hjälp av den relativa celldensiteten (förhållandet mellan den ockuperade ytan och den totala ytan av de förvärvade regionerna).

Fibroblasternas andningsparametrar kommer att övervakas exakt med en högupplöst oxigraf (OROBOROS). Enzymatisk aktivitet av varje komplex i den mitokondriella andningskedjan kommer att mätas med spektrometri, och den mitokondriella membranpotentialen kommer att studeras med fluorescensmikroskopi (TMRM-sond). Utredarna kommer också att studera mitokondriell dynamik och arkitekturen för mitokondriella nätverk med fluorescensmikroskopi och superupplösningsmikroskopi (SRM, Roper). Produktionen av fria radikaler kommer att uppskattas med sonder som är känsliga för oxidativ stress. Slutligen kommer en metabolomisk studie (masspektrometri QTRAP LC/MS/MS 5500 ABSciex) att utföras för att exakt karakterisera metaboliterna i cellerna och för att bedöma deras metaboliska profil.

Utredarna kommer att söka efter proteininneslutningar (mellanliggande filament, TDP43, FUS, ubiquitin) med immunfluorescensteknik. Western Blots kommer att utföras för att studera proteinmetabolismen. Cytoskelettets arkitektur kommer att analyseras i SRM och fluorescensmikroskopi, och utredarna kommer att försöka transfektera fibroblaster för att uttrycka neurofilament och studera konsekvenserna på cytoskelettet och proteinmetabolismen.

Utredarna kommer att studera cellernas svar på stressen (hypoxi SCI-tive Dual, svält) och på åldrande (högt antal passager).