Bioénergétique et métabolisme des protéines dans la sclérose latérale amyotrophique sporadique (Fibro-ALS)

Les chercheurs étudieront des fibroblastes dérivés de patients atteints de SLA sporadique.

Des paramètres cliniques seront recueillis tels que le sexe, l'âge, l'âge de début, la présentation clinique, les paramètres électrophysiologiques et respiratoires, les traitements.

Les fibroblastes dérivés des patients et des témoins seront amplifiés et cultivés à partir de biopsies cutanées.

Les cultures primaires de cellules de fibroblastes proviendront de biopsies cutanées obtenues à partir de sujets témoins et de patients après obtention d'un consentement écrit. Des amplifications seront réalisées, du passage 1 à 6, laissant le temps à la cryoconservation cellulaire de 10 échantillons par lignée cellulaire. Toutes les expériences seront menées sur des cellules avec des nombres de passage similaires, allant de 6 à 25, pour éviter les artefacts dus à la sénescence.

La croissance cellulaire de chaque lignée sera surveillée avec le système IncuCyte ZOOM® (Essen Biosciences), un portique de microscope qui réside dans un incubateur de cellules et un disque dur de contrôleur externe en réseau qui recueille et traite les données d'image. La croissance cellulaire sera automatiquement calculée à chaque instant en utilisant la densité cellulaire relative (rapport de la zone occupée à la surface totale des régions acquises).

Les paramètres respiratoires des fibroblastes seront suivis précisément avec un oxygraphe haute résolution (OROBOROS). L'activité enzymatique de chaque complexe de la chaîne respiratoire mitochondriale sera mesurée par spectrométrie, et le potentiel membranaire mitochondrial sera étudié par microscopie à fluorescence (sonde TMRM). Les chercheurs étudieront également la dynamique mitochondriale et l'architecture du réseau mitochondrial avec la microscopie à fluorescence et la microscopie à super-résolution (SRM, Roper). La production de radicaux libres sera estimée avec des sondes sensibles au stress oxydatif. Enfin, une étude métabolomique (spectrométrie de masse QTRAP LC/MS/MS 5500 ABSciex) sera réalisée pour caractériser précisément les métabolites dans les cellules et évaluer leur profil métabolique.

Les chercheurs rechercheront des inclusions protéiques (filaments intermédiaires, TDP43, FUS, ubiquitine) avec des techniques d'immuno-fluorescence. Des Western Blots seront effectués pour étudier le métabolisme des protéines. L'architecture du cytosquelette sera analysée en SRM et en microscopie à fluorescence, et les chercheurs tenteront de transfecter des fibroblastes afin d'exprimer des neurofilaments et d'étudier les conséquences sur le cytosquelette et le métabolisme des protéines.

Les chercheurs étudieront la réponse des cellules au stress (hypoxie SCI-tive Dual, famine), et à la sénescence (nombres de passages élevés).