Mu-Opioidireseptorin geneettinen polymorfismi ja intratekaalinen analgesia

Tutkimus 1 (intratekaalinen fentanyyli): Ensisijainen tulosmuuttuja on intratekaalisen fentanyylikivun kesto. Kaksipuolinen log rank-testi, jonka kokonaisotoskoko on 152 koehenkilöä (villi tyyppi OPRM1 = 106, variantti OPRM1 = 46), saavuttaa 80 % tehon arvolla α = 0,05 ja havaitsee 0,2:n eron välillä 0,5 ja 0,3 (kohteiden osuus). jatkuva intratekaalinen fentanyylikipuvaikutus 70 minuutin kuluttua). Tämä olettaa, että 70 %:lla koehenkilöistä on villityypin MUOR1-fenotyyppi ja 30 %:lla muunnosfenotyyppi. Odotetun koehenkilön keskeyttämisen huomioon ottamiseksi tutkimukseen otetaan 175 henkilöä.

Tutkimus 2 (intratekaalinen morfiini): Ensisijainen tulosmuuttuja on pelastuskipuvaikutuksen määrä (morfiiniekvivalentit), joka tarvitaan 24 tunnin ajan intratekaalisen morfiiniinjektion jälkeen. 71 koehenkilön kokonaisotoskoko (villityyppi OPRM1 = 50, variantti OPRM1 = 21) saavuttaa 81 %:n tehon havaita 15 mg morfiiniekvivalenttien ero nollahypoteesin, jonka mukaan molemmat ryhmän keskiarvot ovat 40 mg morfiiniekvivalentteja, ja vaihtoehtoisen hypoteesin välillä. yhden ryhmän keskiarvo on 25 mg morfiiniekvivalenttia. Arvioidut ryhmäpoikkeamat ovat 20 mg morfiiniekvivalenttia alfa = 0,05 käyttäen kaksipuolista Mann-Whitney-testiä olettaen, että todellinen jakauma on tasainen. Tämä olettaa, että 70 %:lla koehenkilöistä on villityypin OPRM1-fenotyyppi ja 30 %:lla muunnosfenotyyppi. Odotetun koehenkilön keskeyttämisen huomioon ottamiseksi tutkimukseen otetaan 90 henkilöä.

Protokollakohtaiset menetelmät:

Tutkimus 1: Prenticen naissairaalan työ- ja synnytysyksikköön otetut tukikelpoiset synnyttäjät lähestyvät tutkimukseen osallistumista välittömästi rutiininomaisen nukutusta edeltävän arvioinnin jälkeen. Tämä tapahtuu pian työ- ja toimitusyksikköön pääsyn jälkeen. Naiset, jotka suostuvat osallistumaan, antavat kirjallisen, tietoon perustuvan suostumuksen tällä hetkellä.

Laskimoverta otetaan µ-opioidireseptorigeenin 118-aseman geneettistä analyysiä varten pian sen jälkeen, kun koehenkilö on suostunut osallistumaan tutkimukseen, joko suonensisäisen katetrin kautta, joka on asetettu rutiininomaiseen suonensisäiseen pääsyyn synnytystä ja synnytystä varten, tai tuoreen laskimopunktion kautta. Yhteensä 10 ml verta kerätään kahteen 5 ml:n EDTA-putkeen. Putket eristetään, koodataan ja säilytetään 40 C jääkaapissa, kunnes ne lähetetään (1x/kk) tohtori Landaun hoitamaan tohtori J. L. Blouinin laboratorioon Hopitaux Universitaires de Genevessä. Geneettinen analyysi suoritetaan alla kuvatulla tavalla. Kun koehenkilö pyytää ensimmäisen kerran analgesiaa, hänen kohdunkaulansa tutkitaan (tämä on rutiinitoimenpide ennen analgesian aloittamista). Jos kohdunkaula on laajentunut 2–5 cm, synnyttäjä otetaan mukaan tutkimukseen. Visuaalinen analoginen pistemäärä (VAS) kivulle (100 mm:n viiva, jossa 0 mm = ei kipua ja 100 mm = pahin mahdollinen kipu) määritetään välittömästi ennen analgesian aloittamista. Yhdistetty spinaali-epiduraalinen analgesia aloitetaan istuma-asennossa rutiinin mukaan intratekaalisella fentanyylillä 25 mikrogrammaa. Epiduraalikatetri asetetaan paikalleen. Lääkettä ei ruiskuteta epiduraalikatetrin kautta ennen kuin synnyttäjä pyytää uudelleen analgesiaa. Synnyttäjä asetetaan sivuasentoon, kun epiduraalikatetri on kiinnitetty. VAS määritetään 10 minuuttia intratekaalisen injektion jälkeen.

Ensisijainen tulosmuuttuja on intratekaalisen fentanyylikivun kesto. Kun synnyttäjä pyytää lisäkipulääkettä, kohdunkaula tutkitaan. VAS määritetään. Lisäksi synnyttäneeltä kysytään kutinasta analgesian alkamisesta lähtien (ei mitään, lievä, kohtalainen, vaikea), pahoinvointia (ei mitään, lievä, kohtalainen tai vaikea) ja oksentelua (kyllä, ei). Epiduraalinen testiannos annetaan (lidokaiini 1,5 % epinefriinin kanssa 1:200 000). Olettaen, että testiannos on negatiivinen, 0,125 % bupivakaiinia injektoidaan asteittain aistinvaraiselle tasolle T10. Epiduraalista analgesiaa ylläpidetään potilasohjatulla epiduraalikivulla (PCEA) (bupivakaiini 0,0625 % fentanyylillä 1,95 mikrogrammaa/ml: taustainfuusio 15 ml/h, PCEA-bolus 5 ml, lukitus 10 min, maksimi 30 ml/h) routiinin mukaisesti .

Tutkimus päättyy synnyttäjän synnytyksen ja epiduraaliinfuusion lopettamisen jälkeen. Tässä vaiheessa koehenkilöltä kysytään hänen tyytyväisyydestään synnytyksen analgesiaan (100 mm asteikko, 0 mm = ei ollenkaan tyytyväinen, 100 mm = erittäin tyytyväinen).

Seuraavat tiedot kerätään: äidin ikä, pituus, paino, rotu (itsekuvattu), kohdunkaulan laajeneminen analgesian alussa, aika ja kohdunkaulan laajeneminen toisella kipulääkityspyynnöllä, oksitosiinin enimmäisannos, aika kohdunkaulan laajenemiseen (10 cm) ), toimitusaika, toimitustapa, vastasyntyneen paino, Apgar-pisteet ja napaveren kaasuarvot (saatu osana rutiinihoitoa), epiduraalibupivakaiinin ja muiden paikallispuudutusaineiden kokonaisannos, epiduraalifentanyylin kokonaisannos, PCEA-bolusten määrä ja manuaalisten bolusten lukumäärä (anestesiologin toimesta).

Tapaukset jätetään tietojen analysoinnin ulkopuolelle, jos CSE-analgesiaa ei suoriteta, jos kipua ei ole (VAS > 10 mm) 10 minuuttia intratekaalisen injektion jälkeen (CSE-tekniikan epäonnistuminen), jos kohdunkaulan laajeneminen on 8 cm 60 minuutin sisällä intratekaalisesta injektiosta tai jos potilaalla on keisarileikkaus. Näistä tapauksista ilmoitetaan.

Tutkimus 2: Prenticen naissairaalan työ- ja synnytysyksikköön suunnitellulle keisarileikkaussynnytykselle otettuja naisia ​​pyydetään osallistumaan tutkimukseen välittömästi rutiininomaisen nukutusta edeltävän arvioinnin jälkeen. Tämä tapahtuu pian työ- ja toimitusyksikköön pääsyn jälkeen. Naiset, jotka suostuvat osallistumaan, antavat kirjallisen, tietoon perustuvan suostumuksen tällä hetkellä.

Laskimoverta otetaan µ-opioidireseptorigeenin 118-aseman geneettistä analyysiä varten pian sen jälkeen, kun koehenkilö on suostunut osallistumaan tutkimukseen, joko suonensisäisen katetrin kautta, joka on asetettu rutiininomaiseen suonensisäiseen pääsyyn synnytystä ja synnytystä varten, tai tuoreen laskimopunktion kautta. Yhteensä 10 ml verta kerätään kahteen 5 ml:n EDTA-putkeen. Putket eristetään, koodataan ja säilytetään 4 oC:n jääkaapissa, kunnes ne lähetetään (1 kerran kuukaudessa) tohtori Landaun hoitamaan tohtori J. L. Blouinin laboratorioon Hospitaux Universitaires de Genevessä. Geneettinen analyysi suoritetaan alla kuvatulla tavalla. Rutiininomaista aspiraatioprofylaksia annetaan (laskimonsisäinen ranitidiini ja metoklopramidi sekä oraalinen antasidi). Spinaalipuudutus aloitetaan istuma-asennossa rutiininomaisesti bupivakaiinilla 12 mg (1,6 ml 0,75 % hyperbarista bupivakaiinia), fentanyylillä 15 µg ja morfiinilla 150 mikrogrammaa. Koehenkilöt asetetaan selälleen vasemmalle kohdun asentoon välittömästi intratekaalisen injektion jälkeen. Sensorisen pään salpauksen taso määritetään 30 minuuttia intratekaalisen injektion jälkeen von Frye-karvojen avulla. Koehenkilöt, joiden sensorinen taso on alle T6 tai jotka tarvitsevat intraoperatiivista systeemistä opioidilisää, suljetaan pois jatkotutkimuksesta.

PACU:ssa ja 24 tunnin ajan leikkauksen jälkeen potilaat saavat ibuprofeenia 600 mg po q6h vakioprotokollan mukaisesti. Potilaat voivat pyytää analgesiaa, jos he kokevat epämukavuutta. Pelastuslääkitys sisältää 10 mg hydrokodonia ja 325 mg asetaminofeenia per os. Lisäannos hydrokodonia 10 mg plus asetaminofeenia 325 mg annetaan 1 tunnin kuluttua, jos kipu ei ole helpottunut. Nämä ovat rutiininomaisia ​​suun kautta otettavia kipulääkkeitä postoperatiiviseen keisarileikkauksen synnytyksen analgesiaan. Vakiomääräykset kirjoitetaan rauhoittumisen ja hengitystiheyden seurantaan sekä sivuvaikutusten (pahoinvointi, oksentelu, kutina ja hengityslama) hoitoon.

Ensisijainen tulosmuuttuja on pelastusmorfiinia vastaavan analgesian määrä, joka tarvitaan 24 tunnin aikana intratekaalisen morfiiniinjektion jälkeen.18 Ensimmäisen pelastusanalgesiapyynnön ajankohta merkitään muistiin, ja VAS määritetään pelastuskipulääkettä pyydettäessä. Lisäksi synnyttäjää pyydetään toimittamaan VAS kipua varten 4, 8, 12, 18 ja 24 tuntia intratekaalisen injektion jälkeen. Kutina (ei mitään, lievä, kohtalainen, vaikea), pahoinvointi (ei mitään, lievä, kohtalainen tai vaikea) ja oksentelu (kyllä, ei) määritetään 4 ja 24 tunnin kuluttua intratekaalisen injektion jälkeen.

Tutkimus päättyy 24 tuntia intratekaalisen injektion jälkeen. Tässä vaiheessa koehenkilöltä kysytään hänen tyytyväisyydestään postoperatiiviseen analgesiaan (100 mm asteikko, 0 mm = en ollenkaan tyytyväinen, 100 mm = erittäin tyytyväinen). Tutkimusprotokolla ei määrää lisää analgesiaa.

Seuraavat tiedot kerätään: äidin ikä, pituus, paino, rotu (itsekuvattu), leikkauksensisäisen lisäsedationin tarve, vastasyntyneen paino, kutinan, pahoinvoinnin tai oksentelun intra- tai postoperatiivinen hoito. Ensimmäisen täydentävän oraalisen analgesiapyynnön ajan lisäksi kirjataan seuraavat tiedot: lisäkipulääkkeen annosvaatimukset (asetaminofeeni/hydrokodonitablettien määrä) 4, 8, 12, 18 ja 24 tuntia intratekaalisen injektion jälkeen.

DNA:n keräys: Perifeerinen veri kerätään 2 5 ml:n EDTA-putkeen (yhteensä 10 ml). DNA valmistetaan ei-fenolisilla menetelmillä käyttäen Puregene Blood Extraction Kit -sarjaa (Gentra, Minneapolis, MN) ja testataan molekyylipainon suhteen geelielektroforeesilla ja puhtauden laadun suhteen optisella densitometriamittauksella (suhde 260/280 nm).

SNP-genotyypitys: A118G SNP:n alleelisen jakauman tunnistamiseksi 20-60 ng yksilöiden DNA:ta monistetaan ensin PCR:llä (lämpösyklilaitteissa, jotka on varustettu 96-kuoppaisella mikrotiitterilevylohkolla) käyttämällä alukkeita, jotka on suunniteltu SNP:iden läheisyyteen. . SNP genotyypitetään sitten monistetuissa tuotteissa minisekvensoinnilla (pyrosequencing).

Pyrosekvensointi: PCR käyttäen cDNA-spesifisiä alukkeita (joka kattaa genomisen DNA:n intronin), jossa eteenpäin suuntautuva aluke on leimattu 5'-biotiinilla, suoritetaan standardiolosuhteissa, ja tuote analysoidaan Pyrosequencing-menetelmällä. Lyhyesti sanottuna sisäinen aluke suunnitellaan kaksi nukleotidia ennen mutaatiokohtaa, jotta nämä kaksi mRNA-populaatiota voitaisiin analysoida kvantifioimalla kunkin PCR-tuotteessa läsnä olevan alleelin suhteelliset määrät. Normaalien ja sairastuneiden koehenkilöiden DNA:ta käytetään kontrolleina.

PCR-tuotteet immobilisoidaan Dynabeadsillä (Dynal, Oslo, Norja) inkuboimalla 15 minuuttia 65 oC puskurissa, joka sisältää 10 mM Tris-HCl:a, 2 M NaCl:a, 1 mM EDTA:ta ja 0,1 % Tween 20:tä. Sitten PCR-tuotteet poistetaan liuoksesta magneettierotusta käyttämällä, denaturoidaan 0,5 M NaOH:lla ja pestään 200 mM Tris-asetaatilla, 50 mM MgAc2:lla. Jäljelle jäänyt yksijuosteinen DNA hybridisoidaan sitten sisäisen "sekvensointi"-alukkeen kanssa kuumentamalla seos 80 oC:seen ja jäähdyttämällä se hitaasti huoneenlämpötilaan. Seuraavaksi entsyymi- ja substraattiseokset lisätään automaattisesti jokaiseen kuoppaan, ja reaktiot etenevät 28 oC:ssa lisäämällä peräkkäin yksittäisiä nukleotideja ennalta määrätyssä järjestyksessä. Lusiferaasin piikkien korkeudet ovat verrannollisia nukleotidien inkorporaatioiden lukumäärään, jonka on osoitettu olevan erittäin kvantitatiivista (5 % virheprosentti) useissa kokeellisissa tilanteissa.

Koodatut DNA-näytteet säilytetään tohtori Blouinin laboratoriossa. Sekvensointia ei tehdä enempää, elleivät koehenkilöt allekirjoita suostumuslomaketta myöhempiä tutkimuksia varten.