Polimorfismo genetico del recettore Mu-oppioide e analgesia intratecale

Studio 1 (fentanil intratecale): l'outcome primario è la durata dell'analgesia con fentanil intratecale. Un log rank test a due code con una dimensione complessiva del campione di 152 soggetti (wild type OPRM1 = 106, variante OPRM1 = 46) raggiunge l'80% di potenza a α = 0,05 per rilevare una differenza di 0,2 tra 0,5 e 0,3 (la proporzione di soggetti continuando l'analgesia con fentanil intratecale dopo 70 min). Ciò presuppone che il 70% dei soggetti avrà il fenotipo MUOR1 wild-type e il 30% il fenotipo variante. Per tenere conto dell'abbandono previsto dei soggetti, 175 soggetti saranno arruolati nello studio.

Studio 2 (morfina intratecale): la variabile di esito primaria è la quantità di analgesia di soccorso (equivalenti alla morfina) necessaria per 24 ore dopo l'iniezione intratecale di morfina. Una dimensione complessiva del campione di 71 soggetti (OPRM1 di tipo selvaggio = 50, variante OPRM1 = 21) raggiunge l'81% di potenza per rilevare una differenza di 15 mg di morfina equivalenti tra l'ipotesi nulla che entrambi i gruppi siano equivalenti di 40 mg di morfina e l'ipotesi alternativa che la media di un gruppo è di 25 mg di morfina equivalenti. Le deviazioni standard di gruppo stimate sono equivalenti a 20 mg di morfina con alfa = 0,05 utilizzando un test di Mann-Whitney a due code assumendo che la distribuzione effettiva sia uniforme. Ciò presuppone che il 70% dei soggetti avrà il fenotipo OPRM1 wild-type e il 30% il fenotipo variante. Per tenere conto dell'abbandono previsto del soggetto, 90 soggetti saranno arruolati nello studio.

Metodi specifici del protocollo:

Studio 1: Le partorienti idonee ricoverate presso l'Unità di travaglio e parto del Prentice Women's Hospital verranno contattate per la partecipazione allo studio immediatamente dopo la valutazione preanestetica di routine. Ciò si verifica poco dopo l'ammissione all'Unità di travaglio e parto. Le donne che accettano di partecipare daranno il consenso scritto e informato in questo momento.

Il sangue venoso sarà ottenuto per l'analisi genetica della posizione 118 del gene del recettore μ-oppioide poco dopo che il soggetto acconsente alla partecipazione allo studio, sia attraverso un catetere endovenoso posizionato per l'accesso endovenoso di routine per il travaglio e il parto, sia attraverso una venipuntura fresca. Un totale di 10 ml di sangue verrà raccolto in due provette EDTA da 5 ml. Le provette saranno raggruppate, codificate e conservate in un frigorifero a 40°C fino a quando non saranno inviate (1x/mese) al laboratorio del Dr. J. L. Blouin, a cura del Dr. Landau, presso l'Hopitaux Universitaires de Geneve. L'analisi genetica verrà eseguita come descritto di seguito. Quando il soggetto richiede per la prima volta l'analgesia, la sua cervice verrà esaminata (questa è una procedura di routine prima di iniziare l'analgesia). Se la cervice è dilatata tra 2 e 5 cm, la partoriente sarà inclusa nello studio. Il punteggio analogico visivo (VAS) per il dolore (linea di 100 mm dove 0 mm = nessun dolore e 100 mm = peggior dolore possibile) sarà determinato immediatamente prima dell'inizio dell'analgesia. L'analgesia spinale-epidurale combinata verrà iniziata in posizione seduta per routine con fentanil intratecale 25 microgrammi. Verrà posizionato un catetere epidurale. Nessun farmaco verrà iniettato attraverso il catetere epidurale fino a quando la partoriente non richiederà nuovamente l'analgesia. La partoriente verrà posta in posizione laterale dopo che il catetere epidurale è stato fissato. Una VAS sarà determinata 10 minuti dopo l'iniezione intratecale.

L'outcome primario è la durata dell'analgesia intratecale con fentanil. Nel momento in cui la partoriente richiede ulteriore analgesia, verrà esaminata la cervice. Sarà determinato un VAS. Inoltre, alla partoriente verrà chiesto della presenza di prurito dall'inizio dell'analgesia (nessuno, lieve, moderato, grave), nausea (nessuna, lieve, moderata o grave) e vomito (sì, no). Verrà somministrata una dose di test epidurale (lidocaina 1,5% con epinefrina 1:200.000). Supponendo una dose di prova negativa, la bupivacaina 0,125% verrà iniettata in modo incrementale fino a un livello sensoriale T10. L'analgesia epidurale verrà mantenuta con l'analgesia epidurale controllata dal paziente (PCEA) (bupivacaina 0,0625% con fentanyl 1,95 microgrammi/mL: infusione di base 15 mL/h, bolo PCEA 5 mL, blocco 10 min, massimo 30 mL/h) come da routine .

Lo studio termina dopo che la partoriente ha partorito e l'infusione epidurale è stata interrotta. In questo momento al soggetto verrà chiesto della sua soddisfazione per l'analgesia del travaglio (scala 100 mm, 0 mm = per niente soddisfatta, 100 mm = molto soddisfatta).

Verranno raccolti i seguenti dati: età materna, altezza, peso, razza (auto-descritta), dilatazione cervicale all'inizio dell'analgesia, tempo e dilatazione cervicale alla seconda richiesta di analgesia, dose massima di ossitocina, tempo per completare la dilatazione cervicale (10 cm ), tempo al parto, modalità del parto, peso neonatale, punteggio di Apgar e valori dei gas ematici ombelicali (ottenuti come parte delle cure di routine), dose totale di bupivacaina epidurale e altri anestetici locali, dose totale di fentanil epidurale, numero di boli PCEA e numero di boli manuali (da parte dell'anestesista).

I casi saranno esclusi dall'analisi dei dati se l'analgesia CSE non viene eseguita, se non c'è analgesia (VAS > 10 mm) 10 minuti dopo l'iniezione intratecale (fallimento della tecnica CSE), se la dilatazione cervicale è di 8 cm entro 60 minuti dall'iniezione intratecale , o se il paziente ha un parto cesareo. Questi casi saranno segnalati.

Studio 2: Le donne idonee ricoverate presso l'Unità di travaglio e parto del Prentice Women's Hospital per parto cesareo programmato verranno contattate per la partecipazione allo studio immediatamente dopo la valutazione preanestetica di routine. Ciò si verifica poco dopo l'ammissione all'Unità di travaglio e parto. Le donne che accettano di partecipare daranno il consenso scritto e informato in questo momento.

Il sangue venoso sarà ottenuto per l'analisi genetica della posizione 118 del gene del recettore μ-oppioide poco dopo che il soggetto acconsente alla partecipazione allo studio, sia attraverso un catetere endovenoso posizionato per l'accesso endovenoso di routine per il travaglio e il parto, sia attraverso una venipuntura fresca. Un totale di 10 ml di sangue verrà raccolto in due provette EDTA da 5 ml. Le provette saranno raggruppate, codificate e conservate in un frigorifero a 4°C fino a quando non saranno inviate (1 volta/mese) al laboratorio del Dr. J. L. Blouin, a cura del Dr. Landau, presso gli Hospitaux Universitaires de Geneve. L'analisi genetica verrà eseguita come descritto di seguito. Verrà somministrata la profilassi dell'aspirazione di routine (ranitidina e metoclopramide per via endovenosa e antiacido orale). L'anestesia spinale verrà iniziata in posizione seduta nel modo di routine con bupivacaina 12 mg (1,6 mL 0,75% di bupivacaina iperbarica), fentanil 15 µg e morfina 150 microgrammi. I soggetti verranno collocati nella posizione di spostamento uterino sinistro supino immediatamente dopo l'iniezione intratecale. Il livello di blocco sensoriale cefalico sarà determinato 30 minuti dopo l'iniezione intratecale utilizzando peli di von Frye. I soggetti con un livello sensoriale inferiore a T6, o quelli che richiedono l'integrazione di oppioidi sistemici intraoperatori, saranno esclusi dall'ulteriore partecipazione allo studio.

Nella PACU e per 24 ore dopo l'intervento chirurgico, i pazienti riceveranno ibuprofene 600 mg PO q6h come da protocollo standard. I pazienti possono richiedere l'analgesia di salvataggio se avvertono disagio. Il farmaco di salvataggio consisterà in idrocodone 10 mg più paracetamolo 325 mg per os. Una dose aggiuntiva di idrocodone 10 mg più paracetamolo 325 mg verrà fornita dopo 1 ora se il dolore non viene alleviato. Questi sono farmaci analgesici orali di routine per l'analgesia da parto cesareo postoperatorio. Saranno scritti ordini standard per il monitoraggio della sedazione e della frequenza respiratoria e il trattamento degli effetti collaterali (nausea, vomito, prurito e depressione respiratoria).

L'outcome primario è la quantità di analgesia equivalente alla morfina di emergenza richiesta per le 24 ore successive all'iniezione intratecale di morfina.18 Verrà annotata l'ora della prima richiesta di analgesia di salvataggio e il VAS sarà determinato al momento della richiesta di analgesia di salvataggio. Inoltre, alla partoriente verrà chiesto di fornire una VAS per il dolore a 4, 8, 12, 18 e 24 ore dopo l'iniezione intratecale. La presenza di prurito (nessuno, lieve, moderato, grave), nausea (nessuno, lieve, moderato o grave) e vomito (sì, no) sarà determinata a 4 e 24 ore dopo l'iniezione intratecale.

Lo studio termina 24 ore dopo l'iniezione intratecale. A questo punto al soggetto verrà chiesto della sua soddisfazione per l'analgesia postoperatoria (scala 100 mm, 0 mm = per niente soddisfatto, 100 mm = molto soddisfatto). Ulteriore analgesia non sarà dettata dal protocollo dello studio.

Verranno raccolti i seguenti dati: età materna, altezza, peso, razza (auto-descritta), necessità di sedazione intraoperatoria supplementare, peso neonatale, trattamento intra o postoperatorio per prurito, nausea o vomito. Oltre al momento della prima richiesta di analgesia orale supplementare, verranno registrati i seguenti dati: fabbisogno di dose di analgesia supplementare (numero di compresse di paracetamolo/idrocodone) a 4, 8, 12, 18 e 24 ore dopo l'iniezione intratecale.

Raccolta del DNA: Il sangue periferico sarà raccolto in 2 provette EDTA da 5 ml (totale 10 ml). Il DNA sarà preparato con metodi non fenolici utilizzando il kit di estrazione del sangue Puregene (Gentra, Minneapolis, MN) e testato per peso molecolare su elettroforesi su gel e qualità di purezza mediante misura densitometrica ottica (rapporto 260/280 nm).

Genotipizzazione SNP: per l'identificazione della distribuzione allelica dell'SNP A118G, 20-60 ng di DNA da individui saranno prima amplificati mediante PCR (su apparecchi termociclatori dotati di un blocco di micropiastre a 96 pozzetti) utilizzando primer progettati in prossimità degli SNP . Gli SNP saranno poi genotipizzati in prodotti amplificati mediante minisequenziamento (Pyrosequencing).

Pyrosequencing: la PCR che utilizza primer specifici per cDNA (che coprono un introne nel DNA genomico), in cui il forward primer è marcato con 5' biotina viene eseguita in condizioni standard e il prodotto viene analizzato con il metodo Pyrosequencing. In breve, un primer interno è progettato due nucleotidi prima del sito di mutazione, in modo che le due popolazioni di mRNA possano essere analizzate quantificando le quantità relative di ciascun allele presente nel prodotto di PCR. Il DNA di soggetti normali e affetti viene utilizzato come controllo.

I prodotti PCR vengono immobilizzati con Dynabeads (Dynal, Oslo, Norvegia) mediante un'incubazione di 15 minuti a 65 oC in un tampone contenente 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% Tween 20. I prodotti della PCR vengono quindi rimossi dalla soluzione mediante separazione magnetica, denaturati con NaOH 0,5 M e lavati con Tris-acetato 200 mM, MgAc2 50 mM. Il restante DNA a filamento singolo viene quindi ibridato con il primer di "sequenziamento" interno, riscaldando la miscela a 80°C e raffreddandola lentamente a temperatura ambiente. Le successive miscele di enzima e substrato vengono aggiunte automaticamente a ciascun pozzetto e le reazioni procedono a 28°C, mediante l'aggiunta sequenziale di singoli nucleotidi in un ordine predeterminato. Le altezze dei picchi della luciferasi sono proporzionali al numero di incorporazioni di nucleotidi, che ha dimostrato di essere molto quantitativo (tasso di errore del 5%) in una serie di impostazioni sperimentali.

I campioni di DNA codificati saranno conservati nel laboratorio del Dr. Blouin. Non verrà eseguito alcun ulteriore sequenziamento a meno che i soggetti non abbiano firmato il modulo di consenso per ulteriori studi futuri.