Genetischer Polymorphismus des Mu-Opioid-Rezeptors und intrathekale Analgesie

Studie 1 (intrathekales Fentanyl): Die primäre Ergebnisvariable ist die Dauer der intrathekalen Fentanyl-Analgesie. Ein zweiseitiger Log-Rank-Test mit einer Gesamtstichprobengröße von 152 Probanden (Wildtyp OPRM1 = 106, Variante OPRM1 = 46) erreicht eine Trennschärfe von 80 % bei α = 0,05, um einen Unterschied von 0,2 zwischen 0,5 und 0,3 (dem Anteil der Probanden) festzustellen mit fortgesetzter intrathekaler Fentanyl-Analgesie nach 70 Minuten). Dabei wird davon ausgegangen, dass 70 % der Probanden den Wildtyp-MUOR1-Phänotyp und 30 % den Varianten-Phänotyp aufweisen. Um den voraussichtlichen Studienabbruch zu berücksichtigen, werden 175 Probanden in die Studie aufgenommen.

Studie 2 (intrathekales Morphin): Die primäre Ergebnisvariable ist die Menge an Notfallanalgesie (Morphinäquivalente), die 24 Stunden nach der intrathekalen Morphininjektion erforderlich ist. Eine Gesamtstichprobengröße von 71 Probanden (Wildtyp OPRM1 = 50, Variante OPRM1 = 21) erreicht eine Aussagekraft von 81 %, um einen Unterschied von 15 mg Morphinäquivalenten zwischen der Nullhypothese, dass beide Gruppenmittelwerte 40 mg Morphinäquivalente betragen, und der Alternativhypothese, dass der Mittelwert einer Gruppe beträgt 25 mg Morphinäquivalente. Die geschätzten Gruppenstandardabweichungen betragen 20 mg Morphinäquivalente mit Alpha = 0,05 unter Verwendung eines zweiseitigen Mann-Whitney-Tests unter der Annahme, dass die tatsächliche Verteilung gleichmäßig ist. Hierbei wird davon ausgegangen, dass 70 % der Probanden den Wildtyp-OPRM1-Phänotyp und 30 % den Varianten-Phänotyp aufweisen. Um dem erwarteten Studienabbruch Rechnung zu tragen, werden 90 Studienteilnehmer in die Studie aufgenommen.

Protokollspezifische Methoden:

Studie 1: Geeignete Gebärende, die in die Geburts- und Entbindungsabteilung des Prentice Women's Hospital aufgenommen wurden, werden unmittelbar nach der routinemäßigen präanästhetischen Untersuchung zur Studienteilnahme angesprochen. Dies geschieht kurz nach der Aufnahme in die Arbeits- und Entbindungseinheit. Frauen, die einer Teilnahme zustimmen, geben zu diesem Zeitpunkt eine schriftliche, informierte Einwilligung.

Für die genetische Analyse der Position 118 des µ-Opioidrezeptor-Gens wird venöses Blut entnommen, kurz nachdem der Proband der Teilnahme an der Studie zustimmt, entweder durch einen intravenösen Katheter, der für den routinemäßigen intravenösen Zugang für Wehen und Entbindung platziert wird, oder durch eine frische Venenpunktion. Insgesamt werden 10 ml Blut in zwei 5-ml-EDTA-Röhrchen gesammelt. Die Röhrchen werden zusammengestellt, codiert und in einem Kühlschrank bei 40 °C gelagert, bis sie (1x/Monat) an das Labor von Dr. J. L. Blouin, betreut von Dr. Landau, an den Hopitaux Universitaires de Geneve geschickt werden. Die genetische Analyse wird wie unten beschrieben durchgeführt. Wenn die Patientin zum ersten Mal eine Analgesie wünscht, wird ihr Gebärmutterhals untersucht (dies ist ein Routineverfahren vor Beginn der Analgesie). Wenn der Gebärmutterhals zwischen 2 und 5 cm erweitert ist, wird die Gebärende in die Studie einbezogen. Der visuelle Analogwert (VAS) für Schmerzen (100-mm-Linie, wobei 0 mm = kein Schmerz und 100 mm = schlimmster möglicher Schmerz) wird unmittelbar vor Beginn der Analgesie bestimmt. Die kombinierte spinal-epidurale Analgesie wird routinemäßig in sitzender Position mit intrathekalem Fentanyl 25 Mikrogramm eingeleitet. Es wird ein Epiduralkatheter gelegt. Es wird kein Medikament durch den Epiduralkatheter injiziert, bis der Gebärende erneut eine Analgesie anfordert. Der Gebärende wird in die Seitenlage gebracht, nachdem der Epiduralkatheter befestigt wurde. Ein VAS wird 10 Minuten nach der intrathekalen Injektion bestimmt.

Die primäre Ergebnisvariable ist die Dauer der intrathekalen Fentanyl-Analgesie. Wenn der Gebärende eine zusätzliche Analgesie wünscht, wird der Gebärmutterhals untersucht. Es wird ein VAS ermittelt. Darüber hinaus wird der Gebärende nach dem Vorliegen von Pruritus seit Beginn der Analgesie (keine, leicht, mittelschwer, schwer), Übelkeit (keine, leicht, mittelschwer oder schwer) und Erbrechen (ja, nein) gefragt. Es wird eine epidurale Testdosis verabreicht (Lidocain 1,5 % mit Adrenalin 1:200.000). Unter der Annahme einer negativen Testdosis wird Bupivacain 0,125 % schrittweise bis zum sensorischen T10-Niveau injiziert. Die epidurale Analgesie wird mit patientenkontrollierter epiduraler Analgesie (PCEA) (Bupivacain 0,0625 % mit Fentanyl 1,95 Mikrogramm/ml: Hintergrundinfusion 15 ml/h, PCEA-Bolus 5 ml, Sperre 10 Minuten, maximal 30 ml/h) gemäß Routine aufrechterhalten .

Die Studie endet nach der Entbindung des Gebärenden und dem Absetzen der epiduralen Infusion. Zu diesem Zeitpunkt wird die Testperson nach ihrer Zufriedenheit mit der Wehenanalgesie gefragt (100-mm-Skala, 0 mm = überhaupt nicht zufrieden, 100 mm = sehr zufrieden).

Die folgenden Daten werden erfasst: Alter der Mutter, Größe, Gewicht, Rasse (selbst beschrieben), Erweiterung des Gebärmutterhalses zu Beginn der Analgesie, Zeit und Erweiterung des Gebärmutterhalses bei der 2. Aufforderung zur Analgesie, maximale Oxytocindosis, Zeit bis zur vollständigen Erweiterung des Gebärmutterhalses (10 cm). ), Zeit bis zur Entbindung, Art der Entbindung, Gewicht des Neugeborenen, Apgar-Werte und Nabelblutgaswerte (im Rahmen der Routineversorgung ermittelt), Gesamtdosis von epiduralem Bupivacain und anderen Lokalanästhetika, Gesamtdosis von epiduralem Fentanyl, Anzahl der PCEA-Boli und Anzahl der manuellen Boli (durch den Anästhesisten).

Fälle werden von der Datenanalyse ausgeschlossen, wenn keine CSE-Analgesie durchgeführt wird, wenn 10 Minuten nach der intrathekalen Injektion keine Analgesie (VAS > 10 mm) vorliegt (Versagen der CSE-Technik), wenn die Zervixdilatation innerhalb von 60 Minuten nach der intrathekalen Injektion 8 cm beträgt , oder wenn der Patient einen Kaiserschnitt hat. Diese Fälle werden gemeldet.

Studie 2: Geeignete Frauen, die für eine geplante Kaiserschnitt-Entbindung in die Geburts- und Entbindungsabteilung des Prentice Women's Hospital eingeliefert werden, werden unmittelbar nach der routinemäßigen präanästhetischen Untersuchung zur Studienteilnahme angesprochen. Dies geschieht kurz nach der Aufnahme in die Arbeits- und Entbindungseinheit. Frauen, die einer Teilnahme zustimmen, geben zu diesem Zeitpunkt eine schriftliche, informierte Einwilligung.

Für die genetische Analyse der Position 118 des µ-Opioidrezeptor-Gens wird venöses Blut entnommen, kurz nachdem der Proband der Teilnahme an der Studie zustimmt, entweder durch einen intravenösen Katheter, der für den routinemäßigen intravenösen Zugang für Wehen und Entbindung platziert wird, oder durch eine frische Venenpunktion. Insgesamt werden 10 ml Blut in zwei 5-ml-EDTA-Röhrchen gesammelt. Die Röhrchen werden in Chargen sortiert, codiert und in einem Kühlschrank bei 4 °C gelagert, bis sie (einmal pro Monat) an das Labor von Dr. J. L. Blouin, betreut von Dr. Landau, am Hospitaux Universitaires de Geneve geschickt werden. Die genetische Analyse wird wie unten beschrieben durchgeführt. Es wird eine routinemäßige Aspirationsprophylaxe verabreicht (intravenöses Ranitidin und Metoclopramid sowie orales Antazida). Die Spinalanästhesie wird routinemäßig im Sitzen mit 12 mg Bupivacain (1,6 ml 0,75 % hyperbares Bupivacain), 15 µg Fentanyl und 150 Mikrogramm Morphin eingeleitet. Die Probanden werden unmittelbar nach der intrathekalen Injektion in die Rückenlage zur Verlagerung des linken Uterus gebracht. Der Grad der kopfseitigen sensorischen Blockade wird 30 Minuten nach der intrathekalen Injektion mithilfe von Frye-Haaren bestimmt. Probanden mit einem sensorischen Niveau unter T6 oder solche, die eine intraoperative systemische Opioidergänzung benötigen, werden von der weiteren Studienteilnahme ausgeschlossen.

Auf der Intensivstation und 24 Stunden nach der Operation erhalten die Patienten Ibuprofen 600 mg p.o. alle 6 Stunden gemäß dem Standardprotokoll. Patienten können eine Notfallanalgesie anfordern, wenn sie Beschwerden verspüren. Die Notfallmedikation besteht aus 10 mg Hydrocodon plus 325 mg Paracetamol per os. Eine zusätzliche Dosis Hydrocodon 10 mg plus Paracetamol 325 mg wird nach 1 Stunde verabreicht, wenn die Schmerzen nicht gelindert werden. Hierbei handelt es sich um routinemäßige orale Analgetika zur postoperativen Analgesie nach einem Kaiserschnitt. Es werden Standardanweisungen zur Überwachung der Sedierung und Atemfrequenz sowie zur Behandlung von Nebenwirkungen (Übelkeit, Erbrechen, Juckreiz und Atemdepression) erstellt.

Die primäre Ergebnisvariable ist die Menge an morphinäquivalenter Notfallanalgesie, die für die 24 Stunden nach der intrathekalen Morphininjektion erforderlich ist.18 Der Zeitpunkt der ersten Anforderung einer Notfallanalgesie wird notiert und der VAS wird zum Zeitpunkt der Anforderung einer Notfallanalgesie bestimmt. Darüber hinaus wird der Gebärende gebeten, 4, 8, 12, 18 und 24 Stunden nach der intrathekalen Injektion ein VAS gegen Schmerzen bereitzustellen. Das Vorhandensein von Pruritus (kein, leicht, mittelschwer, schwer), Übelkeit (kein, leicht, mittelschwer oder schwer) und Erbrechen (ja, nein) wird 4 und 24 Stunden nach der intrathekalen Injektion festgestellt.

Die Studie endet 24 Stunden nach der intrathekalen Injektion. Zu diesem Zeitpunkt wird die Testperson nach ihrer Zufriedenheit mit der postoperativen Analgesie gefragt (100-mm-Skala, 0 mm = überhaupt nicht zufrieden, 100 mm = sehr zufrieden). Eine weitere Analgesie wird durch das Studienprotokoll nicht vorgeschrieben.

Folgende Daten werden erhoben: Alter der Mutter, Größe, Gewicht, Rasse (selbst beschrieben), Bedarf an zusätzlicher intraoperativer Sedierung, Gewicht des Neugeborenen, intra- oder postoperative Behandlung von Pruritus, Übelkeit oder Erbrechen. Zusätzlich zur Zeit bis zur ersten Anforderung einer zusätzlichen oralen Analgesie wird Folgendes aufgezeichnet: Dosisbedarf für die zusätzliche Analgesie (Anzahl der Paracetamol-/Hydrocodon-Tabletten) 4, 8, 12, 18 und 24 Stunden nach der intrathekalen Injektion.

DNA-Sammlung: Peripheres Blut wird in 2 5-ml-EDTA-Röhrchen (insgesamt 10 ml) gesammelt. Die DNA wird mit nicht-phenolischen Methoden unter Verwendung des Puregene Blood Extraction Kit (Gentra, Minneapolis, MN) hergestellt und mittels Gelelektrophorese auf Molekulargewicht und Reinheitsqualität durch optische Densitometriemessung (Verhältnis 260/280 nm) getestet.

SNP-Genotypisierung: Zur Identifizierung der Allelverteilung des A118G-SNPs werden 20–60 ng DNA von Individuen zunächst durch PCR (auf Thermocycler-Geräten, die mit einem 96-Well-Mikrotiterplattenblock ausgestattet sind) unter Verwendung von Primern, die in der Nähe der SNPs entwickelt wurden, amplifiziert . Anschließend wird der SNP durch Minisequenzierung (Pyrosequenzierung) in amplifizierten Produkten genotypisiert.

Pyrosequenzierung: Eine PCR mit cDNA-spezifischen Primern (die ein Intron in der genomischen DNA umspannen), bei der der Vorwärtsprimer mit 5'-Biotin markiert wird, wird unter Standardbedingungen durchgeführt und das Produkt wird mit der Pyrosequenzierungsmethode analysiert. Kurz gesagt wird ein interner Primer zwei Nukleotide vor der Mutationsstelle entworfen, sodass die beiden mRNA-Populationen durch Quantifizierung der relativen Mengen jedes im PCR-Produkt vorhandenen Allels untersucht werden können. Als Kontrollen dienen DNA von normalen und erkrankten Probanden.

PCR-Produkte werden mit Dynabeads (Dynal, Oslo, Norwegen) durch eine 15-minütige Inkubation bei 65 °C in einem Puffer mit 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % Tween 20 immobilisiert. PCR-Produkte werden dann mittels magnetischer Trennung aus der Lösung entfernt, mit 0,5 M NaOH denaturiert und mit 200 mM Tris-Acetat und 50 mM MgAc2 gewaschen. Die verbleibende einzelsträngige DNA wird dann mit dem internen „Sequenzierungs“-Primer hybridisiert, indem die Mischung auf 80 °C erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt wird. Die nächsten Enzym- und Substratmischungen werden automatisch in jede Vertiefung gegeben und die Reaktionen laufen bei 28 °C durch die sequentielle Zugabe einzelner Nukleotide in einer vorgegebenen Reihenfolge ab. Die Peakhöhen der Luciferase sind proportional zur Anzahl der Nucleotideinbauten, was sich in einer Reihe experimenteller Situationen als sehr quantitativ (5 % Fehlerrate) erwiesen hat.

Kodierte DNA-Proben werden im Labor von Dr. Blouin gelagert. Es wird keine weitere Sequenzierung durchgeführt, es sei denn, die Probanden haben das Einverständnisformular für weitere zukünftige Studien unterzeichnet.