Genetický polymorfismus mu-opioidních receptorů a intratekální analgezie

Studie 1 (intratekální fentanyl): Primární výslednou proměnnou je trvání intratekální fentanylové analgezie. Dvoustranný log rank test s celkovou velikostí vzorku 152 subjektů (divoký typ OPRM1 = 106, varianta OPRM1 = 46) dosahuje 80% síly při α = 0,05 k detekci rozdílu 0,2 mezi 0,5 a 0,3 (podíl subjektů s pokračující intratekální fentanylovou analgezií po 70 minutách). To předpokládá, že 70 % subjektů bude mít fenotyp MUOR1 divokého typu a 30 % variantní fenotyp. Aby se zohlednilo očekávané vyřazení subjektů, bude do studie zařazeno 175 subjektů.

Studie 2 (intratekální morfin): Primární výslednou proměnnou je množství záchranné analgezie (ekvivalenty morfinu) nutné po dobu 24 hodin po intratekální injekci morfinu. Celková velikost vzorku 71 subjektů (divoký typ OPRM1 = 50, varianta OPRM1 = 21) dosahuje 81% schopnosti detekovat rozdíl 15 mg ekvivalentů morfinu mezi nulovou hypotézou, že průměry obou skupin jsou ekvivalenty 40 mg morfinu, a alternativní hypotézou, že průměr jedné skupiny je 25 mg ekvivalentů morfinu. Odhadované skupinové standardní odchylky jsou 20 mg ekvivalentů morfinu s alfa = 0,05 za použití dvoustranného Mann-Whitneyho testu za předpokladu, že skutečná distribuce je stejnoměrná. To předpokládá, že 70 % subjektů bude mít fenotyp OPRM1 divokého typu a 30 % variantní fenotyp. Aby se zohlednilo očekávané opuštění subjektu, bude do studie zapsáno 90 subjektů.

Metody specifické pro protokol:

Studie 1: Oprávněné rodičky přijaté na porodní a porodní jednotku ženské nemocnice Prentice budou osloveny k účasti ve studii ihned po rutinním preanestetickém vyšetření. K tomu dochází krátce po přijetí na oddělení práce a porodu. Ženy, které souhlasí s účastí, dají v tuto chvíli písemný informovaný souhlas.

Venózní krev bude odebrána pro genetickou analýzu polohy 118 genu u-opioidního receptoru krátce poté, co subjekt souhlasí s účastí ve studii, buď pomocí intravenózního katétru umístěného pro rutinní intravenózní přístup pro porod nebo pomocí čerstvé venepunkce. Do dvou 5ml EDTA zkumavek bude odebráno celkem 10 ml krve. Zkumavky budou dávkovány, kódovány a skladovány v chladničce při 40 C, dokud nebudou odeslány (1x měsíčně) do laboratoře Dr. J. L. Blouina, péče o Dr. Landau, na Hopitaux Universitaires de Geneve. Genetická analýza bude provedena, jak je popsáno níže. Když subjekt poprvé požádá o analgezii, bude jí vyšetřen děložní čípek (toto je rutinní postup před zahájením analgezie). Pokud je děložní hrdlo dilatováno o 2 až 5 cm, bude rodička zařazena do studie. Vizuální analogové skóre (VAS) pro bolest (čára 100 mm, kde 0 mm = žádná bolest a 100 mm = nejhorší možná bolest) bude stanoveno bezprostředně před zahájením analgezie. Kombinovaná spinálně-epidurální analgezie bude zahájena vsedě pomocí intratekálního fentanylu 25 mikrogramů. Bude zaveden epidurální katétr. Epidurálním katétrem nebude aplikován žádný lék, dokud rodič znovu nepožádá o analgezii. Po zajištění epidurálního katétru bude rodička umístěna do laterální polohy. VAS bude stanovena 10 minut po intratekální injekci.

Primární výslednou proměnnou je trvání intratekální fentanylové analgezie. V době, kdy rodička požaduje další analgezii, bude vyšetřen děložní čípek. Bude určen VAS. Kromě toho bude rodička dotázána na přítomnost svědění od zahájení analgezie (žádná, mírná, střední, závažná), nauzea (žádná, mírná, střední nebo závažná) a zvracení (ano, ne). Bude podána epidurální testovací dávka (lidokain 1,5 % s epinefrinem 1:200 000). Za předpokladu negativní testovací dávky bude bupivakain 0,125 % inkrementován postupně na senzorickou hladinu T10. Epidurální analgezie bude udržována pacientem kontrolovanou epidurální analgezií (PCEA) (bupivakain 0,0625 % s fentanylem 1,95 mikrogramů/ml: infuze na pozadí 15 ml/h, PCEA bolus 5 ml, blokování 10 min, maximálně 30 ml/h) jako obvykle .

Studie končí po porodu rodičky a přerušení epidurální infuze. V tomto okamžiku bude subjekt dotázán na její spokojenost s porodní analgezií (100 mm škála, 0 mm = vůbec nespokojená, 100 mm = velmi spokojená).

Budou se shromažďovat následující údaje: věk matky, výška, hmotnost, rasa (sama popsaná), dilatace děložního čípku při zahájení analgezie, čas a dilatace děložního hrdla při 2. žádosti o analgezii, maximální dávka oxytocinu, čas do dokončení dilatace děložního hrdla (10 cm ), doba do porodu, způsob porodu, novorozenecká hmotnost, Apgar skóre a hodnoty plynů z pupečníku (získané jako součást běžné péče), celková dávka epidurálního bupivakainu a dalších lokálních anestetik, celková dávka epidurálního fentanylu, počet bolusů PCEA a počet manuálních bolusů (anesteziologem).

Případy budou z analýzy dat vyloučeny, pokud není provedena analgezie CSE, pokud nedojde k analgezii (VAS > 10 mm) 10 minut po intratekální injekci (selhání techniky CSE), pokud je cervikální dilatace 8 cm během 60 minut po intratekální injekci , nebo pokud má pacientka porod císařským řezem. Tyto případy budou hlášeny.

Studie 2: Vhodné ženy přijaté na porodní a porodní jednotku ženské nemocnice Prentice k plánovanému porodu císařským řezem budou osloveny k účasti ve studii ihned po rutinním preanestetickém hodnocení. K tomu dochází krátce po přijetí na oddělení práce a porodu. Ženy, které souhlasí s účastí, dají v tuto chvíli písemný informovaný souhlas.

Venózní krev bude odebrána pro genetickou analýzu polohy 118 genu u-opioidního receptoru krátce poté, co subjekt souhlasí s účastí ve studii, buď pomocí intravenózního katétru umístěného pro rutinní intravenózní přístup pro porod nebo pomocí čerstvé venepunkce. Do dvou 5ml EDTA zkumavek bude odebráno celkem 10 ml krve. Zkumavky budou dávkovány, kódovány a skladovány v chladničce při teplotě 4 °C, dokud nebudou odeslány (1krát za měsíc) do laboratoře Dr. J. L. Blouina, péče o Dr. Landau, na Hospitaux Universitaires de Geneve. Genetická analýza bude provedena, jak je popsáno níže. Bude podávána rutinní aspirační profylaxe (intravenózní ranitidin a metoklopramid a perorální antacidum). Spinální anestezie bude zahájena v sedě rutinním způsobem bupivakainem 12 mg (1,6 ml 0,75% hyperbarického bupivakainu), fentanylem 15 µg a morfinem 150 mikrogramů. Subjekty budou umístěny do polohy pro posunutí dělohy vlevo na zádech bezprostředně po intratekální injekci. Úroveň senzorické blokády hlavy hlavy bude stanovena 30 minut po intratekální injekci pomocí von Fryeových vlasů. Jedinci se senzorickou úrovní pod T6 nebo ti, kteří vyžadují intraoperační systémovou suplementaci opioidů, budou vyloučeni z další účasti ve studii.

Na PACU a po dobu 24 hodin po operaci budou pacienti dostávat ibuprofen 600 mg po q6h podle standardního protokolu. Pacienti mohou požádat o záchrannou analgezii, pokud pociťují nepohodlí. Záchranná medikace se bude skládat z hydrokodonu 10 mg plus acetaminofenu 325 mg per os. Další dávka hydrokodonu 10 mg plus acetaminofenu 325 mg bude podána po 1 hodině, pokud bolest neustoupí. Jedná se o rutinní perorální analgetika pro pooperační analgezii při porodu císařským řezem. Budou sepsány standardní příkazy pro sledování sedace a dechové frekvence a léčbu vedlejších účinků (nauzea, zvracení, pruritus a respirační deprese).

Primární výslednou proměnnou je množství záchranné analgezie ekvivalentní morfinu požadované po dobu 24 hodin po intratekální injekci morfinu.18 Čas první žádosti o záchrannou analgezii bude zaznamenán a VAS bude stanoven v době žádosti o záchrannou analgezii. Kromě toho bude rodička požádána, aby poskytla VAS pro bolest 4, 8, 12, 18 a 24 hodin po intratekální injekci. Přítomnost svědění (žádná, mírná, střední, závažná), nauzea (žádná, mírná, střední nebo závažná) a zvracení (ano, ne) bude stanovena 4 a 24 hodin po intratekální injekci.

Studie končí 24 hodin po intratekální injekci. V tomto okamžiku bude subjekt dotázán na její spokojenost s pooperační analgezií (škála 100 mm, 0 mm = vůbec nespokojená, 100 mm = velmi spokojená). Další analgezie nebude diktována protokolem studie.

Budou se shromažďovat následující údaje: věk matky, výška, hmotnost, rasa (samozřejmě), požadavek na doplňkovou intraoperační sedaci, novorozenecká hmotnost, intra- nebo pooperační léčba svědění, nevolnosti nebo zvracení. Kromě času do první žádosti o doplňkovou orální analgezii bude zaznamenáno následující: požadavky na dávku analgezie (počet tablet acetaminofenu/hydrokodonu) 4, 8, 12, 18 a 24 hodin po intratekální injekci.

Odběr DNA: Periferní krev bude odebrána do 2 5ml EDTA zkumavek (celkem 10ml). DNA bude připravena nefenolickými metodami pomocí Puregene Blood Extraction Kit (Gentra, Minneapolis, MN) a testována na molekulovou hmotnost na gelové elektroforéze a kvalitu čistoty měřením optické denzitometrie (poměr 260/280 nm).

Genotypizace SNP: Pro identifikaci alelické distribuce A118G SNP bude 20-60 ng DNA od jedinců nejprve amplifikováno pomocí PCR (na termocyklerových přístrojích vybavených blokem mikrotitrační destičky s 96 jamkami) s použitím primerů navržených v blízkosti SNP . SNP pak bude genotypován v amplifikovaných produktech minisekvenováním (Pyrosequencing).

Pyrosekvenování: PCR s použitím cDNA specifických primerů (překlenující intron v genomové DNA), ve kterém je dopředný primer značený 5' biotinem, se provádí za standardních podmínek a produkt se analyzuje metodou Pyrosequencing. Stručně řečeno, vnitřní primer je navržen dva nukleotidy před místem mutace, takže dvě populace mRNA mohou být testovány kvantifikací relativních množství každé alely přítomné v produktu PCR. DNA od normálních a postižených subjektů se používá jako kontrola.

Produkty PCR jsou imobilizovány pomocí Dynabeads (Dynal, Oslo, Norsko) 15 minutovou inkubací při 65 oC v pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA a 0,1 % Tween 20. Produkty PCR se poté odstraní z roztoku pomocí magnetické separace, denaturují se 0,5M NaOH a promyjí se 200mM Tris-acetátem, 50mM MgAc2. Zbývající jednořetězcová DNA se poté hybridizuje s vnitřním „sekvenačním“ primerem zahřátím směsi na 80 °C a pomalým ochlazením na pokojovou teplotu. Do každé jamky se automaticky přidají další směsi enzymů a substrátů a reakce probíhají při 28 °C postupným přidáváním jednotlivých nukleotidů v předem určeném pořadí. Výšky píku luciferázy jsou úměrné počtu inkorporací nukleotidů, což se ukázalo jako velmi kvantitativní (5% chybovost) v řadě experimentálních nastavení.

Vzorky kódované DNA budou uloženy v laboratoři Dr. Blouina. Žádné další sekvenování nebude provedeno, pokud subjekty nepodepíší formulář souhlasu pro další budoucí studie.