Mu-opioid receptor genetikai polimorfizmus és intratekális fájdalomcsillapítás

1. vizsgálat (intratekális fentanil): Az elsődleges kimeneti változó az intratekális fentanil fájdalomcsillapítás időtartama. Egy kétoldalú log rank teszt 152 alany teljes mintájával (vad típusú OPRM1 = 106, OPRM1 változat = 46) 80%-os teljesítményt ér el α = 0,05 mellett, így 0,5 és 0,3 (az alanyok aránya) között 0,2-es különbséget észlel. folyamatos intratekális fentanil fájdalomcsillapítással 70 perc után). Ez azt feltételezi, hogy az alanyok 70%-a rendelkezik a vad típusú MUOR1 fenotípussal, és 30%-a a variáns fenotípussal. Az alanyok várható lemorzsolódása miatt 175 alanyt vonnak be a vizsgálatba.

2. vizsgálat (intratekális morfin): Az elsődleges kimeneti változó az intratekális morfin injekció után 24 órán keresztül szükséges mentő fájdalomcsillapítás (morfin-ekvivalensek) mennyisége. A 71 alanyból álló teljes mintanagyság (vad típusú OPRM1 = 50, OPRM1 változat = 21) 81%-os teljesítményt ér el a 15 mg morfin ekvivalens különbség kimutatására a nullhipotézis között, miszerint mindkét csoport átlaga 40 mg morfin egyenérték, és az alternatív hipotézis között, az egyik csoport átlaga 25 mg morfin ekvivalens. A becsült csoport szórása 20 mg morfin ekvivalens, alfa = 0,05 kétoldali Mann-Whitney teszttel, feltételezve, hogy a tényleges eloszlás egyenletes. Ez azt feltételezi, hogy az alanyok 70%-a rendelkezik a vad típusú OPRM1 fenotípussal, és 30%-a a variáns fenotípussal. Az alanyok várható lemorzsolódásának figyelembevétele érdekében 90 alanyt vonnak be a vizsgálatba.

Protokollspecifikus módszerek:

1. vizsgálat: A Prentice Női Kórház Munkaügyi és Szülési Osztályára felvett, jogosult szülést azonnal megkeresik a vizsgálatban való részvétel céljából a rutin preanesztetikus értékelés után. Ez röviddel a Munkaügyi és Szállítási Osztályra való felvétel után következik be. Azok a nők, akik beleegyeznek a részvételbe, írásos, tájékozott hozzájárulásukat adják.

Vénás vért vesznek a µ-opioid receptor gén 118-as pozíciójának genetikai elemzéséhez röviddel azután, hogy az alany beleegyezett a vizsgálatban való részvételbe, akár egy intravénás katéteren keresztül, amelyet a vajúdáshoz és a szüléshez rutin intravénás hozzáféréshez helyeznek el, vagy egy friss vénapunkcióval. Összesen 10 ml vért gyűjtünk két 5 ml-es EDTA-csőbe. A csöveket adagolják, kódolják és 40 C-os hűtőszekrényben tárolják, amíg elküldik őket (1x/hónap) Dr. J. L. Blouin laboratóriumába, Dr. Landau gondozásában, a Hopitaux Universitaires de Geneve-ben. A genetikai elemzést az alábbiakban leírtak szerint végezzük. Amikor az alany először kér fájdalomcsillapítást, a méhnyakát megvizsgálják (ez a fájdalomcsillapítás megkezdése előtti rutin eljárás). Ha a méhnyak 2 és 5 cm között tágult, a szülést bevonják a vizsgálatba. A fájdalom vizuális analóg pontszámát (VAS) (100 mm-es vonal, ahol 0 mm = nincs fájdalom és 100 mm = a lehető legrosszabb fájdalom) közvetlenül a fájdalomcsillapítás megkezdése előtt kell meghatározni. A kombinált spinális-epidurális fájdalomcsillapítást rutinonként ülő helyzetben kell elindítani 25 mikrogramm intratekális fentanillal. Epidurális katétert helyeznek el. Az epidurális katéteren keresztül semmilyen gyógyszert nem fecskendeznek be, amíg a szülõ ismét fájdalomcsillapítást nem kér. Az epidurális katéter rögzítése után a szülõt oldalirányú helyzetbe kell helyezni. A VAS meghatározása 10 perccel az intratekális injekció után történik.

Az elsődleges kimeneti változó az intratekális fentanil fájdalomcsillapítás időtartama. Amikor a szülõ további fájdalomcsillapítást kér, a méhnyakot megvizsgálják. Meg kell határozni a VAS-t. Ezenkívül a szülést megkérdezik a fájdalomcsillapítás kezdete óta jelentkező viszketésről (nincs, enyhe, közepes, súlyos), hányingerről (nincs, enyhe, közepes vagy súlyos) és hányásról (igen, nem). Epidurális tesztdózist kell beadni (lidokain 1,5%, epinefrin 1:200 000). Negatív tesztdózist feltételezve a 0,125%-os bupivakaint fokozatosan adják be a T10 szenzoros szintig. Az epidurális fájdalomcsillapítás a beteg által kontrollált epidurális fájdalomcsillapítással (PCEA) lesz fenntartva (bupivakain 0,0625% fentanillal 1,95 mikrogramm/ml: háttérinfúzió 15 ml/h, PCEA bolus 5 ml, lockout 10 perc, maximum 30 ml/óra) a routin szerint. .

A vizsgálat a szülõ szülése és az epidurális infúzió leállítása után ér véget. Ekkor az alanytól megkérdezik, hogy mennyire elégedett a szülési fájdalomcsillapítással (100 mm-es skála, 0 mm = egyáltalán nem elégedett, 100 mm = nagyon elégedett).

A következő adatokat gyűjtjük: anyai életkor, magasság, testsúly, rassz (saját leírás), nyaki tágulás a fájdalomcsillapítás megkezdésekor, idő és nyaki tágulás a fájdalomcsillapítás második kérésekor, maximális oxitocin dózis, teljes méhnyak tágulási idő (10 cm). ), a szülésig eltelt idő, a szülés módja, az újszülött súlya, az Apgar-pontszámok és a köldökvérgáz-értékek (a rutin ellátás részeként), az epidurális bupivakain és más helyi érzéstelenítők teljes dózisa, az epidurális fentanil teljes dózisa, a PCEA bólusok száma és kézi bólusok száma (az aneszteziológus által).

Azok az esetek kizárásra kerülnek az adatelemzésből, ha CSE fájdalomcsillapításra nem kerül sor, ha nincs fájdalomcsillapítás (VAS > 10 mm) 10 perccel az intratekális injekció beadása után (a CSE technika sikertelensége), ha az intratekális injekció beadása után 60 percen belül 8 cm-es nyaki tágulás , vagy ha a páciens császármetszéssel szült. Ezeket az eseteket jelenteni fogják.

2. vizsgálat: A Prentice Női Kórház Munkaügyi és Szülési Osztályán tervezett császármetszés céljából felvett jogosult nőket a rutin preanesztetikus értékelés után azonnal felkérik a vizsgálatban való részvételre. Ez röviddel a Munkaügyi és Szállítási Osztályra való felvétel után következik be. Azok a nők, akik beleegyeznek a részvételbe, írásos, tájékozott hozzájárulásukat adják.

Vénás vért vesznek a µ-opioid receptor gén 118-as pozíciójának genetikai elemzéséhez röviddel azután, hogy az alany beleegyezett a vizsgálatban való részvételbe, akár egy intravénás katéteren keresztül, amelyet a vajúdáshoz és a szüléshez rutin intravénás hozzáféréshez helyeznek el, vagy egy friss vénapunkcióval. Összesen 10 ml vért gyűjtünk két 5 ml-es EDTA-csőbe. A csöveket adagolják, kódolják és 4°C-os hűtőszekrényben tárolják, amíg elküldik őket (1 alkalommal/hónap) Dr. J. L. Blouin laboratóriumába, Dr. Landau gondozásában, a Hospitaux Universitaires de Geneve-ben. A genetikai elemzést az alábbiakban leírtak szerint kell elvégezni. Rutinszerű aspirációs profilaxist kell alkalmazni (intravénás ranitidin és metoklopramid, valamint orális antacid). A spinális érzéstelenítést ülő helyzetben, rutinszerűen indítjuk 12 mg bupivakainnal (1,6 ml 0,75%-os hiperbár bupivakain), 15 µg fentanillal és 150 mikrogramm morfinnal. Az alanyokat közvetlenül az intratekális injekció beadása után hanyatt fekvő, bal oldali méh elmozdulásba kell helyezni. A fejfej szenzoros blokád szintjét az intratekális injekció után 30 perccel von Frye szőrszálak segítségével határozzuk meg. Azok a személyek, akiknek szenzoros szintje T6 alatt van, vagy akik intraoperatív szisztémás opioid-kiegészítést igényelnek, kizárásra kerülnek a további vizsgálatokból.

A PACU-ban és a műtét után 24 órán keresztül a betegek 600 mg ibuprofént kapnak naponta 6 órán keresztül a standard protokoll szerint. A betegek mentő fájdalomcsillapítást kérhetnek, ha kényelmetlenséget tapasztalnak. A mentő gyógyszer 10 mg hidrokodonból és 325 mg acetaminofenből áll majd per os. Ha a fájdalom nem enyhül, 1 óra elteltével további 10 mg hidrokodon plusz 325 mg acetaminofén adagolására kerül sor. Ezek rutin orális fájdalomcsillapító gyógyszerek a posztoperatív császármetszés fájdalomcsillapítására. Szabványos rendeléseket írnak ki a szedáció és a légzési gyakoriság monitorozására, valamint a mellékhatások (hányinger, hányás, viszketés és légzésdepresszió) kezelésére.

Az elsődleges kimeneti változó az intratekális morfin injekciót követő 24 órában szükséges mentő morfin-ekvivalens fájdalomcsillapítás mennyisége.18 A rendszer feljegyzi az első mentési fájdalomcsillapítás kérésének időpontját, és a VAS-t a mentési fájdalomcsillapítás kérésének időpontjában határozzák meg. Ezenkívül a szülõt felkérik, hogy 4, 8, 12, 18 és 24 órával az intratekális injekció beadása után fájdalomérzékelést biztosítson. A viszketés (nincs, enyhe, közepes, súlyos), hányinger (nincs, enyhe, közepes vagy súlyos) és hányás (igen, nem) jelenlétét az intratekális injekció beadása után 4 és 24 órával határozzák meg.

A vizsgálat az intratekális injekció beadása után 24 órával ér véget. Ekkor az alanytól megkérdezik, hogy mennyire elégedett a posztoperatív fájdalomcsillapítással (100 mm-es skála, 0 mm = egyáltalán nem elégedett, 100 mm = nagyon elégedett). A további fájdalomcsillapítást a vizsgálati protokoll nem írja elő.

A következő adatokat gyűjtjük össze: anyai életkor, magasság, testsúly, rassz (saját leírás), kiegészítő intraoperatív szedáció szükségessége, újszülött súlya, viszketés, hányinger vagy hányás intra- vagy posztoperatív kezelése. A kiegészítő orális fájdalomcsillapítás első igénylésének időpontján túlmenően a következőket rögzítjük: a kiegészítő fájdalomcsillapítás dózisigénye (acetaminofen/hidrokodon tabletták száma) 4, 8, 12, 18 és 24 órával az intratekális injekció után.

DNS gyűjtés: A perifériás vért 2 db 5 ml-es EDTA csőben (összesen 10 ml) gyűjtjük. A DNS-t nem fenolos módszerekkel állítják elő Puregene Blood Extraction Kit (Gentra, Minneapolis, MN) segítségével, és molekulatömeget gélelektroforézissel, valamint tisztasági minőséget optikai denzitometriás méréssel (260/280 nm arány) tesztelik.

SNP genotipizálás: Az A118G SNP alléleloszlásának azonosításához az egyénekből származó 20-60 ng DNS-t először PCR-rel amplifikálják (96 lyukú mikrotiter lemez blokkjával felszerelt termociklusos készülékeken) az SNP-k közelében tervezett primerek felhasználásával. . Az SNP-t ezután amplifikált termékekben miniszekvenálással (Pyrosequencing) genotipizálják.

Piroszekvenálás: cDNS-specifikus primerekkel (a genomiális DNS-ben egy intront átívelő) PCR-rel, amelyben a forward primert 5'-biotinnal jelöltük, standard körülmények között végezzük, és a terméket a Pyrosequencing módszerrel analizáljuk. Röviden, egy belső primert két nukleotiddal a mutációs hely előtt terveznek meg, így a két mRNS-populációt a PCR-termékben jelenlévő egyes allélok relatív mennyiségének mennyiségi meghatározásával lehet megvizsgálni. Normál és érintett alanyokból származó DNS-t használunk kontrollként.

A PCR-termékeket Dynabeads-szel (Dynal, Oslo, Norvégia) immobilizáljuk 10 mM Tris-HCl-t, 2M NaCl-t, 1 mM EDTA-t és 0,1% Tween 20-at tartalmazó pufferben 15 perces, 65 oC-os inkubálással. A PCR-termékeket ezután mágneses elválasztással eltávolítjuk az oldatból, 0,5 M NaOH-val denaturáljuk, és 200 mM Tris-acetáttal, 50 mM MgAc2-vel mossuk. A megmaradt egyszálú DNS-t ezután hibridizálják a belső „szekvenáló” primerrel, a keveréket 80 oC-ra melegítve, majd lassan szobahőmérsékletre hűtve. A következő enzim- és szubsztrátkeverékeket automatikusan hozzáadjuk minden egyes lyukhoz, és a reakciók 28 oC-on mennek végbe, egyes nukleotidok egymás utáni hozzáadásával, előre meghatározott sorrendben. A luciferáz csúcsmagasságai arányosak a nukleotid beépülések számával, amely számos kísérleti beállításban nagyon kvantitatívnak bizonyult (5%-os hibaarány).

A kódolt DNS-mintákat Dr. Blouin laboratóriumában tárolják. További szekvenálást nem végeznek, kivéve, ha az alanyok aláírták a hozzájárulási űrlapot a további jövőbeli vizsgálatokhoz.