Генетический полиморфизм мю-опиоидных рецепторов и интратекальное обезболивание

Исследование 1 (интратекальный фентанил): первичным исходным параметром является продолжительность интратекального обезболивания фентанилом. Двусторонний логарифмический ранговый тест с общим размером выборки 152 субъекта (OPRM1 дикого типа = 106, вариант OPRM1 = 46) достигает мощности 80% при α = 0,05, чтобы обнаружить разницу 0,2 между 0,5 и 0,3 (доля субъектов с продолжающейся интратекальной анальгезией фентанилом через 70 мин). Это предполагает, что 70% субъектов будут иметь фенотип MUOR1 дикого типа, а 30% - вариантный фенотип. Для учета ожидаемого отсева субъектов в исследование будет включено 175 субъектов.

Исследование 2 (интратекальное введение морфина): первичным исходным параметром является объем экстренной анальгезии (эквиваленты морфина), необходимый в течение 24 ч после интратекального введения морфина. Общий размер выборки из 71 субъекта (дикий тип OPRM1 = 50, вариант OPRM1 = 21) достигает мощности 81% для обнаружения разницы в 15 мг эквивалентов морфина между нулевой гипотезой о том, что обе группы означают эквиваленты морфина 40 мг, и альтернативной гипотезой о том, что среднее значение для одной группы составляет 25 мг морфина в эквиваленте. Расчетные групповые стандартные отклонения составляют эквиваленты морфина 20 мг с альфа = 0,05 с использованием двустороннего критерия Манна-Уитни, предполагая, что фактическое распределение является однородным. Это предполагает, что 70% субъектов будут иметь фенотип OPRM1 дикого типа, а 30% - вариантный фенотип. Для учета ожидаемого отсева субъектов в исследование будет включено 90 субъектов.

Специальные методы протокола:

Исследование 1. Подходящие роженицы, поступившие в отделение родовспоможения женской больницы Прентис, будут приглашены для участия в исследовании сразу после плановой преданестезиологической оценки. Это происходит вскоре после поступления в отделение родовспоможения. Женщины, которые соглашаются участвовать, дадут письменное информированное согласие в это время.

Венозная кровь будет получена для генетического анализа положения 118 гена μ-опиоидного рецептора вскоре после того, как субъект согласится на участие в исследовании, либо через внутривенный катетер, установленный для обычного внутривенного доступа во время родов, либо через свежую венепункцию. Всего 10 мл крови будет собрано в две 5 мл пробирки с ЭДТА. Пробирки будут группироваться, кодироваться и храниться в холодильнике при температуре 40°С до тех пор, пока они не будут отправлены (1 раз в месяц) в лабораторию доктора Дж. Л. Блуэна, на попечение доктора Ландау, в Университете Женевы. Генетический анализ будет проводиться, как описано ниже. Когда субъект впервые попросит обезболивание, ее шейка матки будет осмотрена (это рутинная процедура, предшествующая началу обезболивания). Если раскрытие шейки матки составляет от 2 до 5 см, роженица будет включена в исследование. Визуально-аналоговая оценка (ВАШ) боли (линия 100 мм, где 0 мм = отсутствие боли и 100 мм = сильная возможная боль) будет определяться непосредственно перед началом обезболивания. Комбинированная спинально-эпидуральная анестезия будет начата в положении сидя в соответствии с установленной процедурой с интратекальным введением 25 мкг фентанила. Будет установлен эпидуральный катетер. Никакое лекарство не будет вводиться через эпидуральный катетер, пока роженица снова не потребует обезболивания. Роженица будет помещена в боковое положение после закрепления эпидурального катетера. ВАШ будет определяться через 10 минут после интратекальной инъекции.

Первичной конечной переменной является продолжительность интратекального обезболивания фентанилом. Когда роженица потребует дополнительной анальгезии, будет обследована шейка матки. VAS будет определен. Кроме того, роженицу спросят о наличии зуда с момента начала обезболивания (отсутствует, легкая, умеренная, сильная), тошноты (отсутствует, легкая, умеренная или сильная) и рвоты (да, нет). Будет введена эпидуральная тестовая доза (лидокаин 1,5% с адреналином 1:200 000). Предполагая отрицательную тестовую дозу, бупивакаин 0,125% будет вводиться постепенно до сенсорного уровня T10. Эпидуральная анальгезия будет поддерживаться с помощью контролируемой пациентом эпидуральной анальгезии (ЭАН) (бупивакаин 0,0625% с фентанилом 1,95 мкг/мл: фоновая инфузия 15 мл/ч, ЭЭА болюс 5 мл, блокировка 10 мин, максимум 30 мл/ч) в соответствии с обычной практикой. .

Исследование заканчивается после родов роженицы и прекращения эпидуральной инфузии. В это время субъекту будет задан вопрос о ее удовлетворенности обезболиванием родов (шкала 100 мм, 0 мм = совсем не удовлетворена, 100 мм = очень удовлетворена).

Будут собраны следующие данные: возраст матери, рост, вес, раса (самоописание), раскрытие шейки матки в начале обезболивания, время и раскрытие шейки матки при 2-м запросе на обезболивание, максимальная доза окситоцина, время до полного раскрытия шейки матки (10 см). ), время до родов, способ родоразрешения, масса тела новорожденного, баллы по шкале Апгар и значения газов пуповинной крови (полученные в рамках плановой медицинской помощи), общая доза эпидурального бупивакаина и других местных анестетиков, общая доза эпидурального фентанила, количество болюсов PCEA и количество ручных болюсов (определяется анестезиологом).

Случаи будут исключены из анализа данных, если обезболивание КСЭ не проводится, если обезболивание отсутствует (ВАШ > 10 мм) через 10 минут после интратекальной инъекции (неудача техники КСЭ), если раскрытие шейки матки составляет 8 см в течение 60 минут интратекальной инъекции , или если у пациентки кесарево сечение. Об этих случаях будет сообщено.

Исследование 2. Подходящим женщинам, поступившим в отделение родовспоможения женской больницы Прентис для планового кесарева сечения, будет предложено принять участие в исследовании сразу после плановой преданестезиологической оценки. Это происходит вскоре после поступления в отделение родовспоможения. Женщины, которые соглашаются участвовать, дадут письменное информированное согласие в это время.

Венозная кровь будет получена для генетического анализа положения 118 гена μ-опиоидного рецептора вскоре после того, как субъект согласится на участие в исследовании, либо через внутривенный катетер, установленный для обычного внутривенного доступа во время родов, либо через свежую венепункцию. Всего 10 мл крови будет собрано в две 5 мл пробирки с ЭДТА. Пробирки будут группироваться, кодироваться и храниться в холодильнике при температуре 4oC до отправки (1 раз в месяц) в лабораторию д-ра Дж. Л. Блуэна, на попечение д-ра Ландау, в Университетском госпитале Женевы. Генетический анализ будет выполнен, как описано ниже. Будет проведена рутинная профилактика аспирации (внутривенно ранитидин и метоклопрамид и пероральный антацид). Спинномозговая анестезия будет начата в сидячем положении обычным способом с помощью 12 мг бупивакаина (1,6 мл 0,75% гипербарического бупивакаина), 15 мкг фентанила и 150 мкг морфина. Субъектов помещают в положение смещения матки влево на спину сразу после интратекальной инъекции. Уровень сенсорной блокады головного мозга определяют через 30 минут после интратекальной инъекции с помощью волосков фон Фрая. Субъекты с сенсорным уровнем ниже T6 или те, которым требуется интраоперационная системная опиоидная добавка, будут исключены из дальнейшего участия в исследовании.

В PACU и в течение 24 часов после операции пациенты будут получать ибупрофен по 600 мг перорально каждые 6 часов в соответствии со стандартным протоколом. Пациенты могут запросить неотложную анальгезию, если они испытывают дискомфорт. Спасательное лекарство будет состоять из 10 мг гидрокодона плюс 325 мг ацетаминофена per os. Дополнительная доза гидрокодона 10 мг плюс ацетаминофен 325 мг будет предоставлена ​​через 1 час, если боль не уменьшится. Это рутинные пероральные анальгетики для обезболивания родов после операции кесарева сечения. Стандартные предписания будут написаны для мониторинга седативного эффекта и частоты дыхания, а также для лечения побочных эффектов (тошноты, рвоты, зуда и угнетения дыхания).

Первичной конечной переменной является количество анальгезии, эквивалентной морфину, необходимой в течение 24 часов после интратекальной инъекции морфина.18 Будет отмечено время первого запроса на неотложную анальгезию, и ВАШ будет определена во время запроса на неотложную анальгезию. Кроме того, роженицу попросят оценить боль по ВАШ через 4, 8, 12, 18 и 24 часа после интратекальной инъекции. Наличие зуда (отсутствие, легкая, умеренная, сильная), тошноты (отсутствие, легкая, умеренная или сильная) и рвоты (да, нет) будет определяться через 4 и 24 ч после интратекальной инъекции.

Исследование заканчивается через 24 ч после интратекальной инъекции. В это время субъекта спросят о ее удовлетворенности послеоперационным обезболиванием (шкала 100 мм, 0 мм = совсем не удовлетворена, 100 мм = очень удовлетворена). Дальнейшее обезболивание не будет продиктовано протоколом исследования.

Будут собраны следующие данные: возраст матери, рост, вес, раса (самоописание), потребность в дополнительной интраоперационной седации, вес новорожденного, интра- или послеоперационное лечение зуда, тошноты или рвоты. Помимо времени до первого запроса на дополнительную пероральную анальгезию, будет зарегистрировано следующее: потребность в дополнительной дозе анальгезии (количество таблеток ацетаминофена/гидрокодона) через 4, 8, 12, 18 и 24 часа после интратекальной инъекции.

Сбор ДНК: Периферическую кровь собирают в 2 пробирки с ЭДТА по 5 мл (всего 10 мл). ДНК будет приготовлена ​​нефенольными методами с использованием набора для экстракции крови Puregen (Gentra, Миннеаполис, Миннесота) и проверена на молекулярную массу с помощью гель-электрофореза и качество чистоты с помощью оптической денситометрии (соотношение 260/280 нм).

Генотипирование SNP: для идентификации аллельного распределения SNP A118G 20–60 нг ДНК индивидуумов сначала будут амплифицированы с помощью ПЦР (на термоциклерах, оснащенных блоком 96-луночных микротитровальных планшетов) с использованием праймеров, разработанных вблизи SNP. . Затем SNP будет генотипирован в амплифицированных продуктах с помощью мини-секвенирования (пиросеквенирования).

Пиросеквенирование: ПЦР с использованием кДНК-специфических праймеров (перекрывающих интрон в геномной ДНК), в которых прямой праймер помечен 5'-биотином, проводят в стандартных условиях, а продукт анализируют методом пиросеквенирования. Вкратце, внутренний праймер конструируют за два нуклеотида до сайта мутации, чтобы можно было проанализировать две популяции мРНК путем количественного определения относительных количеств каждого аллеля, присутствующего в продукте ПЦР. ДНК здоровых и пораженных субъектов используют в качестве контроля.

Продукты ПЦР иммобилизовали с помощью Dynabeads (Dynal, Осло, Норвегия) путем 15-минутной инкубации при 65 oC в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 2M NaCl, 1 мМ EDTA и 0,1% Tween 20. Затем продукты ПЦР удаляют из раствора с помощью магнитной сепарации, денатурируют 0,5 М NaOH и промывают 200 мМ трис-ацетатом, 50 мМ MgAc2. Затем оставшуюся одноцепочечную ДНК гибридизуют с внутренним праймером для секвенирования путем нагревания смеси до 80°C и медленного охлаждения до комнатной температуры. Следующие смеси ферментов и субстратов автоматически добавляются в каждую лунку, и реакции продолжаются при 28oC путем последовательного добавления одиночных нуклеотидов в заданном порядке. Высота пиков люциферазы пропорциональна количеству включений нуклеотидов, которое, как было показано, является очень количественным (коэффициент ошибки 5%) в ряде экспериментальных настроек.

Закодированные образцы ДНК будут храниться в лаборатории доктора Блуэна. Никакое дальнейшее секвенирование не будет проводиться, если субъекты не подпишут форму согласия на дальнейшие будущие исследования.