Polimorfizm genetyczny receptora opioidowego Mu i analgezja dooponowa

Badanie 1 (fentanyl dokanałowy): Podstawową zmienną wyniku jest czas trwania znieczulenia fentanylem podanym dooponowo. Dwustronny test logarytmiczny rang z całkowitą wielkością próby 152 osób (typ dziki OPRM1 = 106, wariant OPRM1 = 46) osiąga moc 80% przy α = 0,05, aby wykryć różnicę 0,2 między 0,5 a 0,3 (odsetek badanych z kontynuacją analgezji dooponowej fentanylu po 70 min). Zakłada się, że 70% osobników będzie miało fenotyp MUOR1 typu dzikiego, a 30% fenotyp wariantu. Aby uwzględnić przewidywany spadek liczby uczestników, do badania zostanie włączonych 175 osób.

Badanie 2 (morfina dooponowa): Podstawową zmienną wyniku jest ilość doraźnego środka przeciwbólowego (ekwiwalent morfiny) niezbędnego przez 24 godziny po dooponowym wstrzyknięciu morfiny. Ogólna wielkość próby 71 osób (typ dziki OPRM1 = 50, wariant OPRM1 = 21) osiąga 81% mocy do wykrycia różnicy 15 mg równoważników morfiny między hipotezą zerową, że obie średnie grupowe wynoszą 40 mg równoważników morfiny, a hipotezą alternatywną, że średnia dla jednej grupy wynosi 25 mg równoważników morfiny. Oszacowane odchylenia standardowe grupowe wynoszą 20 mg ekwiwalentu morfiny z alfa = 0,05 przy użyciu dwustronnego testu Manna-Whitneya przy założeniu, że rzeczywisty rozkład jest jednorodny. Zakłada się, że 70% osobników będzie miało fenotyp OPRM1 typu dzikiego, a 30% wariant fenotypu. Aby uwzględnić przewidywany spadek liczby uczestników, do badania zostanie włączonych 90 osób.

Metody specyficzne dla protokołu:

Badanie 1: Kwalifikujące się rodzące przyjęte na Oddział Porodowy Szpitala Prentice dla kobiet zostaną poproszone o udział w badaniu natychmiast po rutynowej ocenie przed znieczuleniem. Ma to miejsce wkrótce po przyjęciu do Oddziału Pracy i Porodów. Kobiety, które wyrażą zgodę na udział, wyrażą w tej chwili pisemną, świadomą zgodę.

Krew żylna zostanie pobrana do analizy genetycznej pozycji 118 genu receptora opioidowego µ wkrótce po wyrażeniu przez pacjentkę zgody na udział w badaniu, albo przez cewnik dożylny umieszczony w rutynowym dostępie dożylnym w celu porodu i porodu, albo przez świeże nakłucie żyły. Łącznie 10 ml krwi zostanie pobrane do dwóch 5 ml probówek z EDTA. Probówki będą podzielone na partie, kodowane i przechowywane w lodówce w temperaturze 40°C do czasu wysłania (1x/miesiąc) do laboratorium dr J. L. Blouina, pod opieką dr Landau, na Hopitaux Universitaires de Geneve. Analiza genetyczna zostanie przeprowadzona w sposób opisany poniżej. Gdy pacjentka po raz pierwszy poprosi o znieczulenie, zostanie zbadana jej szyjka macicy (jest to rutynowa procedura przed rozpoczęciem znieczulenia). Jeśli szyjka macicy jest rozwarta między 2 a 5 cm, rodząca zostanie objęta badaniem. Wizualny wynik analogowy (VAS) dla bólu (linia 100 mm, gdzie 0 mm = brak bólu i 100 mm = najgorszy możliwy ból) zostanie określony bezpośrednio przed rozpoczęciem analgezji. Połączona analgezja podpajęczynówkowo-zewnątrzoponowa zostanie rozpoczęta w pozycji siedzącej zgodnie z rutynowym podaniem dokanałowego fentanylu w dawce 25 mikrogramów. Zostanie założony cewnik zewnątrzoponowy. Żaden lek nie zostanie wstrzyknięty przez cewnik zewnątrzoponowy, dopóki rodząca nie poprosi ponownie o znieczulenie. Rodząca zostanie ułożona w pozycji bocznej po zabezpieczeniu cewnika zewnątrzoponowego. VAS zostanie określony 10 minut po wstrzyknięciu dokanałowym.

Podstawową zmienną wyniku jest czas trwania dooponowego znieczulenia fentanylem. W momencie, gdy rodząca poprosi o dodatkowe znieczulenie, szyjka macicy zostanie zbadana. VAS zostanie określony. Dodatkowo rodząca zostanie zapytana o obecność świądu od początku analgezji (brak, łagodny, umiarkowany, silny), nudności (brak, łagodny, umiarkowany lub ciężki) oraz wymiotów (tak, nie). Podana zostanie próbna dawka zewnątrzoponowa (lidokaina 1,5% z epinefryną 1:200 000). Zakładając ujemną dawkę testową, bupiwakaina 0,125% zostanie wstrzyknięta stopniowo do poziomu sensorycznego T10. Znieczulenie zewnątrzoponowe będzie utrzymywane za pomocą znieczulenia zewnątrzoponowego kontrolowanego przez pacjenta (PCEA) (bupiwakaina 0,0625% z fentanylem 1,95 mikrogramów/ml: infuzja podstawowa 15 ml/h, bolus PCEA 5 ml, blokada 10 min, maksymalnie 30 ml/h) zgodnie z rutyną .

Badanie kończy się po porodzie i przerwaniu wlewu zewnątrzoponowego. W tym czasie pacjentka zostanie zapytana o jej zadowolenie z analgezji porodu (skala 100 mm, 0 mm = w ogóle niezadowolona, ​​100 mm = bardzo zadowolona).

Zostaną zebrane następujące dane: wiek matki, wzrost, waga, rasa (opis własny), rozwarcie szyjki macicy na początku analgezji, czas i rozwarcie szyjki macicy na 2. żądanie znieczulenia, maksymalna dawka oksytocyny, czas do całkowitego rozwarcia szyjki macicy (10 cm ), czas do porodu, sposób porodu, masę ciała noworodka, punktację w skali Apgar i gazometrię krwi pępowinowej (uzyskaną w ramach rutynowej opieki), całkowitą dawkę bupiwakainy zewnątrzoponowej i innych środków miejscowo znieczulających, całkowitą dawkę zewnątrzoponowego fentanylu, liczbę bolusów PCEA i liczba bolusów ręcznych (przez anestezjologa).

Przypadki zostaną wykluczone z analizy danych, jeśli nie zostanie wykonana analgezja CSE, jeśli nie wystąpi analgezja (VAS > 10 mm) 10 minut po wstrzyknięciu dooponowym (niepowodzenie techniki CSE), jeśli rozwarcie szyjki macicy wyniesie 8 cm w ciągu 60 minut od wstrzyknięcia dokanałowego lub jeśli pacjentka ma cesarskie cięcie. Te przypadki będą zgłaszane.

Badanie 2: Kwalifikujące się kobiety przyjęte na oddział porodowo-porodowy Szpitala Prentice dla kobiet w celu planowanego cięcia cesarskiego zostaną poproszone o udział w badaniu natychmiast po rutynowej ocenie przed znieczuleniem. Ma to miejsce wkrótce po przyjęciu do Oddziału Pracy i Porodów. Kobiety, które wyrażą zgodę na udział, wyrażą w tej chwili pisemną, świadomą zgodę.

Krew żylna zostanie pobrana do analizy genetycznej pozycji 118 genu receptora opioidowego µ wkrótce po wyrażeniu przez pacjentkę zgody na udział w badaniu, albo przez cewnik dożylny umieszczony w rutynowym dostępie dożylnym w celu porodu i porodu, albo przez świeże nakłucie żyły. Łącznie 10 ml krwi zostanie pobrane do dwóch 5 ml probówek z EDTA. Probówki będą podzielone na partie, kodowane i przechowywane w lodówce w temperaturze 4oC do momentu wysłania (1 raz w miesiącu) do laboratorium dr J. L. Blouina, pod opieką dr Landau, w Hospitaux Universitaires de Geneve. Analiza genetyczna zostanie przeprowadzona w sposób opisany poniżej. Zostanie zastosowana rutynowa profilaktyka aspiracyjna (dożylne podanie ranitydyny i metoklopramidu oraz doustne leki zobojętniające kwas żołądkowy). Znieczulenie podpajęczynówkowe zostanie rozpoczęte w pozycji siedzącej w rutynowy sposób za pomocą 12 mg bupiwakainy (1,6 ml 0,75% hiperbarycznej bupiwakainy), 15 µg fentanylu i 150 mikrogramów morfiny. Pacjentki zostaną umieszczone w pozycji leżącej na plecach z przemieszczeniem lewej macicy natychmiast po wstrzyknięciu dokanałowym. Poziom blokady czuciowej dogłowowej zostanie określony 30 min po wstrzyknięciu dooponowym za pomocą włosów von Frye'a. Osoby z poziomem sensorycznym poniżej T6 lub wymagające śródoperacyjnej ogólnoustrojowej suplementacji opioidami zostaną wykluczone z dalszego udziału w badaniu.

W PACU i przez 24 godziny po zabiegu pacjenci będą otrzymywać ibuprofen w dawce 600 mg doustnie co 6 godzin zgodnie ze standardowym protokołem. Pacjenci mogą poprosić o ratunkową analgezję, jeśli odczuwają dyskomfort. Lek ratunkowy będzie składał się z hydrokodonu 10 mg plus acetaminofenu 325 mg per os. Dodatkowa dawka 10 mg hydrokodonu plus 325 mg acetaminofenu zostanie podana po 1 godzinie, jeśli ból nie ustąpi. Są to rutynowe doustne leki przeciwbólowe stosowane w znieczuleniu pooperacyjnym po cięciu cesarskim. Zostaną wypisane standardowe zlecenia monitorowania sedacji i częstości oddechów oraz leczenia działań niepożądanych (nudności, wymioty, świąd i depresja oddechowa).

Pierwszorzędową zmienną wyniku jest ilość doraźnego ekwiwalentu morfiny jako środka przeciwbólowego wymaganego przez 24 godziny po dooponowym wstrzyknięciu morfiny.18 Godzina pierwszego wezwania do ratunkowej analgezji zostanie odnotowana, a VAS zostanie określony w momencie wezwania do ratunkowej analgezji. Ponadto rodząca zostanie poproszona o wykonanie VAS bólu po 4, 8, 12, 18 i 24 godzinach po wstrzyknięciu dokanałowym. Obecność świądu (brak, łagodny, umiarkowany, ciężki), nudności (brak, łagodny, umiarkowany lub ciężki) i wymiotów (tak, nie) zostanie określona po 4 i 24 godzinach od wstrzyknięcia dokanałowego.

Badanie kończy się 24 godziny po wstrzyknięciu dokanałowym. W tym czasie badana zostanie zapytana o swoje zadowolenie z analgezji pooperacyjnej (skala 100 mm, 0 mm = w ogóle niezadowolona, ​​100 mm = bardzo zadowolona). Dalsza analgezja nie będzie podyktowana protokołem badania.

Zostaną zebrane następujące dane: wiek matki, wzrost, waga, rasa (opis własny), zapotrzebowanie na dodatkową sedację śródoperacyjną, waga noworodka, śród- lub pooperacyjne leczenie świądu, nudności lub wymiotów. Oprócz czasu do pierwszego wezwania do uzupełnienia doustnej analgezji, rejestrowane będą następujące informacje: zapotrzebowanie na dodatkową dawkę analgezji (liczba tabletek acetaminofenu/hydrokodonu) po 4, 8, 12, 18 i 24 godzinach po wstrzyknięciu dokanałowym.

Pobieranie DNA: Krew obwodowa zostanie pobrana do 2 5 ml probówek z EDTA (łącznie 10 ml). DNA zostanie przygotowane metodami niefenolowymi przy użyciu zestawu Puregene Blood Extraction Kit (Gentra, Minneapolis, MN) i zbadane pod kątem masy cząsteczkowej metodą elektroforezy żelowej oraz jakości czystości za pomocą pomiaru densytometrii optycznej (stosunek 260/280 nm).

Genotypowanie SNP: W celu identyfikacji rozmieszczenia allelicznego SNP A118G, 20-60 ng DNA od osobników zostanie najpierw zamplifikowane metodą PCR (na aparatach do termocyklerów wyposażonych w 96-dołkowy blok płytek do mikromiareczkowania) przy użyciu starterów zaprojektowanych w pobliżu SNP . SNP będzie następnie genotypowany w zamplifikowanych produktach przez minisekwencjonowanie (pirosekwencjonowanie).

Pirosekwencjonowanie: PCR przy użyciu starterów specyficznych dla cDNA (obejmujących intron w genomowym DNA), w którym starter przedni jest znakowany biotyną 5', przeprowadza się w standardowych warunkach, a produkt analizuje się metodą pirosekwencjonowania. W skrócie, wewnętrzny starter jest projektowany dwa nukleotydy przed miejscem mutacji, tak aby dwie populacje mRNA mogły być badane przez ilościowe określenie względnych ilości każdego allelu obecnego w produkcie PCR. Jako kontrole stosuje się DNA osobników zdrowych i dotkniętych chorobą.

Produkty PCR unieruchamia się za pomocą Dynabeads (Dynal, Oslo, Norwegia) przez 15 minut inkubacji w temperaturze 65 oC w buforze zawierającym 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA i 0,1% Tween 20. Produkty PCR są następnie usuwane z roztworu za pomocą separacji magnetycznej, denaturowane 0,5 M NaOH i przemywane 200 mM Tris-octanem, 50 mM MgAc2. Pozostały jednoniciowy DNA jest następnie hybrydyzowany z wewnętrznym starterem „sekwencjonującym”, poprzez podgrzanie mieszaniny do 80oC i powolne schłodzenie do temperatury pokojowej. Do każdej studzienki automatycznie dodawane są kolejne mieszaniny enzymów i substratów, a reakcje przebiegają w temperaturze 28oC, poprzez sekwencyjne dodawanie pojedynczych nukleotydów w ustalonej kolejności. Wysokości pików lucyferazy są proporcjonalne do liczby włączonych nukleotydów, co w wielu ustawieniach eksperymentalnych okazało się bardzo ilościowe (5% wskaźnika błędu).

Zakodowane próbki DNA będą przechowywane w laboratorium dr Blouina. Żadne dalsze sekwencjonowanie nie zostanie wykonane, chyba że badani podpiszą formularz zgody na dalsze przyszłe badania.