Mu-opioïde receptor genetisch polymorfisme en intrathecale analgesie

Studie 1 (intrathecale fentanyl): de primaire uitkomstvariabele is de duur van intrathecale fentanyl-analgesie. Een tweezijdige log-ranktest met een totale steekproefomvang van 152 proefpersonen (wildtype OPRM1 = 106, variant OPRM1 = 46) behaalt een vermogen van 80% bij α = 0,05 om een ​​verschil van 0,2 tussen 0,5 en 0,3 te detecteren (het aantal proefpersonen met aanhoudende intrathecale fentanyl-analgesie na 70 minuten). Dit veronderstelt dat 70% van de proefpersonen het wildtype MUOR1-fenotype zal hebben en 30% het variant-fenotype. Om rekening te houden met de verwachte uitval van proefpersonen, zullen 175 proefpersonen aan het onderzoek deelnemen.

Studie 2 (intrathecale morfine): De primaire uitkomstvariabele is de hoeveelheid nood-analgesie (morfine-equivalenten) die nodig is gedurende 24 uur na de intrathecale morfine-injectie. Een totale steekproefomvang van 71 proefpersonen (wildtype OPRM1 = 50, variant OPRM1 = 21) behaalt 81% vermogen om een ​​verschil van 15 mg morfine-equivalenten te detecteren tussen de nulhypothese dat beide groepsgemiddelden 40 mg morfine-equivalenten zijn en de alternatieve hypothese dat het gemiddelde van één groep is 25 mg morfine-equivalenten. De geschatte standaarddeviaties van de groep zijn 20 mg morfine-equivalenten met alfa = 0,05 met behulp van een tweezijdige Mann-Whitney-test, waarbij wordt aangenomen dat de daadwerkelijke verdeling uniform is. Dit veronderstelt dat 70% van de proefpersonen het wildtype OPRM1-fenotype zal hebben en 30% het variant-fenotype. Om rekening te houden met de verwachte uitval van proefpersonen, zullen 90 proefpersonen aan het onderzoek deelnemen.

Protocolspecifieke methoden:

Onderzoek 1: in aanmerking komende parturiënten die worden opgenomen op de arbeids- en bevallingsafdeling van het Prentice Women's Hospital zullen onmiddellijk na de routinematige pre-anesthetische evaluatie worden benaderd voor deelname aan het onderzoek. Dit gebeurt kort na opname op de Labor and Delivery Unit. Vrouwen die ermee instemmen om deel te nemen, zullen op dit moment schriftelijke, geïnformeerde toestemming geven.

Veneus bloed zal worden verkregen voor genetische analyse van de 118-positie van het μ-opioïdereceptorgen kort nadat de proefpersoon toestemming heeft gegeven voor deelname aan het onderzoek, hetzij via een intraveneuze katheter die is geplaatst voor routinematige intraveneuze toegang voor bevalling en bevalling, of via een nieuwe aderpunctie. Er wordt in totaal 10 ml bloed verzameld in twee EDTA-buisjes van 5 ml. De buisjes worden gegroepeerd, gecodeerd en bewaard in een koelkast van 40°C totdat ze worden verzonden (1x/maand) naar het laboratorium van Dr. J. L. Blouin, onder zorg van Dr. Landau, aan de Hopitaux Universitaires de Geneve. Genetische analyse zal worden uitgevoerd zoals hieronder beschreven. Wanneer de proefpersoon voor het eerst om analgesie verzoekt, zal haar baarmoederhals worden onderzocht (dit is een routineprocedure voorafgaand aan het initiëren van analgesie). Als de baarmoederhals tussen 2 en 5 cm verwijd is, wordt de parturiënte in het onderzoek opgenomen. Visuele analoge score (VAS) voor pijn (lijn van 100 mm waarbij 0 mm = geen pijn en 100 mm = ergst mogelijke pijn) zal worden bepaald onmiddellijk voordat de analgesie wordt gestart. Gecombineerde spinale-epidurale analgesie wordt routinematig gestart in zittende houding met intrathecaal fentanyl 25 microgram. Er wordt een epidurale katheter geplaatst. Er wordt geen medicijn door de epidurale katheter geïnjecteerd totdat de parturiënte opnieuw om analgesie verzoekt. De bevalling wordt in zijligging geplaatst nadat de epidurale katheter is vastgezet. 10 minuten na de intrathecale injectie wordt een VAS bepaald.

De primaire uitkomstvariabele is de duur van intrathecale fentanyl-analgesie. Op het moment dat de parturiënte om aanvullende analgesie vraagt, wordt de baarmoederhals onderzocht. Er wordt een VAS vastgesteld. Bovendien zal de parturiënte worden gevraagd naar de aanwezigheid van pruritus sinds de start van analgesie (geen, licht, matig, ernstig), misselijkheid (geen, licht, matig of ernstig) en braken (ja, nee). Er wordt een epidurale testdosis toegediend (lidocaïne 1,5% met epinefrine 1:200.000). Uitgaande van een negatieve testdosis, zal bupivacaïne 0,125% stapsgewijs worden geïnjecteerd tot een T10 sensorisch niveau. Epidurale analgesie wordt gehandhaafd met door de patiënt gecontroleerde epidurale analgesie (PCEA) (bupivacaïne 0,0625% met fentanyl 1,95 microgram/ml: achtergrondinfusie 15 ml/uur, PCEA-bolus 5 ml, uitsluiting 10 min, maximaal 30 ml/uur) volgens routine .

Het onderzoek eindigt nadat de bevalling is bevallen en de epidurale infusie is stopgezet. Op dit moment wordt de proefpersoon gevraagd naar haar tevredenheid met arbeidsanalgesie (100 mm schaal, 0 mm = helemaal niet tevreden, 100 mm = zeer tevreden).

De volgende gegevens worden verzameld: leeftijd van de moeder, lengte, gewicht, ras (zelf beschreven), cervicale dilatatie bij aanvang van analgesie, tijd en cervicale dilatatie bij 2e verzoek om analgesie, maximale dosis oxytocine, tijd tot volledige cervicale dilatatie (10 cm ), tijd tot bevalling, wijze van bevalling, neonataal gewicht, Apgar-scores en navelstrengbloedgaswaarden (verkregen als onderdeel van routinematige zorg), totale dosis epidurale bupivacaïne en andere lokale anesthetica, totale dosis epidurale fentanyl, aantal PCEA-bolussen en aantal manuele bolussen (door de anesthesioloog).

Gevallen worden uitgesloten van gegevensanalyse als CSE-analgesie niet wordt uitgevoerd, als er geen analgesie is (VAS > 10 mm) 10 minuten na de intrathecale injectie (falen van CSE-techniek), als cervicale dilatatie 8 cm is binnen 60 minuten na intrathecale injectie , of als de patiënt een keizersnede heeft ondergaan. Deze gevallen zullen worden gemeld.

Studie 2: Geschikte vrouwen die zijn opgenomen op de arbeids- en bevallingsafdeling van het Prentice Women's Hospital voor een geplande keizersnede, zullen onmiddellijk na de routinematige pre-anesthetische evaluatie worden benaderd voor deelname aan de studie. Dit gebeurt kort na opname op de Labor and Delivery Unit. Vrouwen die ermee instemmen om deel te nemen, zullen op dit moment schriftelijke, geïnformeerde toestemming geven.

Veneus bloed zal worden verkregen voor genetische analyse van de 118-positie van het μ-opioïdereceptorgen kort nadat de proefpersoon toestemming heeft gegeven voor deelname aan het onderzoek, hetzij via een intraveneuze katheter die is geplaatst voor routinematige intraveneuze toegang voor bevalling en bevalling, of via een nieuwe aderpunctie. Er wordt in totaal 10 ml bloed verzameld in twee EDTA-buisjes van 5 ml. De buisjes worden gegroepeerd, gecodeerd en bewaard in een koelkast bij 4oC totdat ze worden verzonden (1 keer/maand) naar het laboratorium van Dr. J.L. Blouin, onder zorg van Dr. Landau, aan de Hospitaux Universitaires de Geneve. Genetische analyse zal worden uitgevoerd zoals hieronder beschreven Routinematige aspiratieprofylaxe zal worden toegediend (intraveneuze ranitidine en metoclopramide en orale antacidum). Spinale anesthesie wordt in de zittende positie op routinematige wijze gestart met bupivacaïne 12 mg (1,6 ml 0,75% hyperbare bupivacaïne), fentanyl 15 µg en morfine 150 microgram. De proefpersonen zullen onmiddellijk na de intrathecale injectie in de liggende positie van de linker baarmoeder worden geplaatst. Het niveau van cephalad sensorische blokkade zal worden bepaald 30 minuten na de intrathecale injectie met behulp van von Frye haren. Proefpersonen met een sensorisch niveau onder T6, of degenen die intraoperatieve systemische opioïde-suppletie nodig hebben, zullen worden uitgesloten van verdere deelname aan het onderzoek.

In de PACU en gedurende 24 uur na de operatie krijgen patiënten ibuprofen 600 mg po elke 6 uur volgens het standaardprotocol. Patiënten kunnen reddingsanalgesie aanvragen als ze ongemak ervaren. Reddingsmedicatie zal bestaan ​​uit hydrocodon 10 mg plus paracetamol 325 mg per os. Een extra dosis hydrocodon 10 mg plus paracetamol 325 mg wordt na 1 uur gegeven als de pijn niet wordt verlicht. Dit zijn routinematige orale analgetische medicatie voor postoperatieve pijnstilling bij een keizersnede. Standaardorders zullen worden geschreven voor het bewaken van sedatie en ademhalingsfrequentie en behandeling van bijwerkingen (misselijkheid, braken, pruritus en ademhalingsdepressie).

De primaire uitkomstvariabele is de hoeveelheid nood-morfine-equivalente analgesie die nodig is gedurende 24 uur na de intrathecale morfine-injectie.18 Het tijdstip van het eerste verzoek om reddingsanalgesie wordt genoteerd en de VAS wordt bepaald op het moment dat om reddingsanalgesie wordt verzocht. Bovendien zal de parturiënte worden gevraagd om een ​​VAS voor pijn te geven op 4, 8, 12, 18 en 24 uur na de intrathecale injectie. De aanwezigheid van pruritus (geen, licht, matig, ernstig), misselijkheid (geen, licht, matig of ernstig) en braken (ja, nee) zal 4 en 24 uur na de intrathecale injectie worden vastgesteld.

De studie eindigt 24 uur na de intrathecale injectie. Op dit moment wordt de proefpersoon gevraagd naar haar tevredenheid over postoperatieve analgesie (100 mm schaal, 0 mm = helemaal niet tevreden, 100 mm = zeer tevreden). Verdere analgesie wordt niet voorgeschreven door het onderzoeksprotocol.

De volgende gegevens worden verzameld: leeftijd van de moeder, lengte, gewicht, ras (zelf beschreven), vereiste voor aanvullende intraoperatieve sedatie, neonataal gewicht, intra- of postoperatieve behandeling van pruritus, misselijkheid of braken. Naast de tijd tot het eerste verzoek om aanvullende orale analgesie, wordt het volgende geregistreerd: aanvullende analgesie dosisvereisten (aantal paracetamol / hydrocodon-tabletten) op 4, 8, 12, 18 en 24 uur na de intrathecale injectie.

DNA-afname: Perifeer bloed wordt afgenomen in 2 EDTA-buisjes van 5 ml (totaal 10 ml). DNA zal worden bereid met behulp van niet-fenolische methoden met behulp van Puregene Blood Extraction Kit (Gentra, Minneapolis, MN) en getest op molecuulgewicht op gelelektroforese en zuiverheidskwaliteit door middel van optische densitometrie (verhouding 260/280 nm).

SNP-genotypering: voor identificatie van allelische distributie van de A118G SNP, zal 20-60 ng DNA van individuen eerst worden geamplificeerd door PCR (op thermocycler-apparaten die zijn uitgerust met een microtiterplaatblok met 96 putjes) met behulp van primers die zijn ontworpen in de buurt van de SNP's . De SNP zal vervolgens gegenotypeerd worden in geamplificeerde producten door middel van minisequencing (Pyrosequencing).

Pyrosequencing: PCR met behulp van cDNA-specifieke primers (die een intron in genomisch DNA overspannen), waarbij de voorwaartse primer is gelabeld met 5'-biotine, wordt uitgevoerd onder standaardomstandigheden en het product wordt geanalyseerd met de Pyrosequencing-methode. In het kort wordt een interne primer twee nucleotiden voor de mutatieplaats ontworpen, zodat de twee mRNA-populaties kunnen worden getest door de relatieve hoeveelheden van elk allel aanwezig in het PCR-product te kwantificeren. DNA van normale en getroffen proefpersonen wordt gebruikt als controles.

PCR-producten worden geïmmobiliseerd met Dynabeads (Dynal, Oslo, Noorwegen) door een incubatie van 15 minuten bij 65 °C in een buffer die 10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA en 0,1% Tween 20 bevat. PCR-producten worden vervolgens uit de oplossing verwijderd met behulp van magnetische scheiding, gedenatureerd met NaOH 0,5 M en gewassen met 200 mM Tris-acetaat, 50 mM MgAc2. Het resterende enkelstrengs DNA wordt vervolgens gehybridiseerd met de interne 'sequencing'-primer, door het mengsel te verwarmen tot 80oC en langzaam af te koelen tot kamertemperatuur. Volgende enzym- en substraatmengsels worden automatisch aan elk putje toegevoegd en de reacties verlopen bij 28oC, door achtereenvolgende toevoeging van enkele nucleotiden in een vooraf bepaalde volgorde. Luciferase-piekhoogten zijn evenredig met het aantal nucleotide-opnamen, waarvan is aangetoond dat het zeer kwantitatief is (5% foutenpercentage) in een aantal experimentele instellingen.

Gecodeerde DNA-monsters worden opgeslagen in het laboratorium van Dr. Blouin. Er zal geen verdere sequentiëring worden uitgevoerd tenzij proefpersonen het toestemmingsformulier voor verdere toekomstige studies hebben ondertekend.