Polimorfismo genético del receptor opioide Mu y analgesia intratecal

Estudio 1 (fentanilo intratecal): la variable de resultado primaria es la duración de la analgesia con fentanilo intratecal. Una prueba de rango logarítmico bilateral con un tamaño de muestra general de 152 sujetos (tipo salvaje OPRM1 = 106, variante OPRM1 = 46) logra una potencia del 80 % en α = 0,05 para detectar una diferencia de 0,2 entre 0,5 y 0,3 (la proporción de sujetos con continuación de la analgesia intratecal con fentanilo después de 70 min). Esto supone que el 70 % de los sujetos tendrá el fenotipo MUOR1 de tipo salvaje y el 30 % el fenotipo variante. Para tener en cuenta el abandono previsto de los sujetos, se inscribirán 175 sujetos en el estudio.

Estudio 2 (morfina intratecal): la variable de resultado primaria es la cantidad de analgesia de rescate (equivalentes de morfina) necesaria durante 24 h después de la inyección de morfina intratecal. Un tamaño de muestra general de 71 sujetos (tipo salvaje OPRM1 = 50, variante OPRM1 = 21) logra un poder del 81 % para detectar una diferencia de 15 mg de equivalentes de morfina entre la hipótesis nula de que las medias de ambos grupos son 40 mg de equivalentes de morfina y la hipótesis alternativa de que la media de un grupo es de 25 mg de equivalentes de morfina. Las desviaciones estándar estimadas del grupo son equivalentes de morfina de 20 mg con alfa = 0,05 usando una prueba de Mann-Whitney de dos colas suponiendo que la distribución real es uniforme. Esto supone que el 70 % de los sujetos tendrá el fenotipo OPRM1 de tipo salvaje y el 30 % el fenotipo variante. Para tener en cuenta el abandono previsto de los sujetos, se inscribirán 90 sujetos en el estudio.

Métodos específicos del protocolo:

Estudio 1: Las parturientas elegibles admitidas en la Unidad de trabajo de parto y parto del Prentice Women's Hospital serán contactadas para participar en el estudio inmediatamente después de la evaluación preanestésica de rutina. Esto ocurre poco después de la admisión a la Unidad de Labor y Parto. Las mujeres que acepten participar darán su consentimiento informado por escrito en este momento.

Se obtendrá sangre venosa para el análisis genético de la posición 118 del gen del receptor µ-opioide poco después de que el sujeto dé su consentimiento para participar en el estudio, ya sea a través de un catéter intravenoso colocado para el acceso intravenoso de rutina para el trabajo de parto y el parto, o a través de una venopunción fresca. Se recolectará un total de 10 ml de sangre en dos tubos con EDTA de 5 ml. Los tubos se dosificarán, codificarán y almacenarán en un refrigerador a 40 °C hasta que se envíen (1 vez al mes) al laboratorio del Dr. J. L. Blouin, a cargo del Dr. Landau, en los Hopitaux Universitaires de Geneve. El análisis genético se realizará como se describe a continuación. Cuando el sujeto solicita analgesia por primera vez, se examinará su cuello uterino (este es un procedimiento de rutina antes de iniciar la analgesia). Si el cuello uterino está dilatado entre 2 y 5 cm, la parturienta será incluida en el estudio. La puntuación analógica visual (VAS) para el dolor (línea de 100 mm donde 0 mm = sin dolor y 100 mm = el peor dolor posible) se determinará inmediatamente antes del inicio de la analgesia. La analgesia combinada espinal-epidural se iniciará en la posición sentada de forma rutinaria con fentanilo intratecal 25 microgramos. Se colocará un catéter epidural. No se inyectará ningún fármaco a través del catéter epidural hasta que la parturienta solicite nuevamente analgesia. La parturienta se colocará en posición lateral después de asegurar el catéter epidural. Se determinará una EVA 10 min después de la inyección intratecal.

La variable de resultado principal es la duración de la analgesia intratecal con fentanilo. En el momento en que la parturienta solicita analgesia adicional, se examinará el cuello uterino. Se determinará un EVA. Además, se preguntará a la parturienta sobre la presencia de prurito desde el inicio de la analgesia (ninguno, leve, moderado, severo), náuseas (ninguno, leve, moderado o severo) y vómitos (sí, no). Se administrará una dosis epidural de prueba (lidocaína al 1,5% con epinefrina 1:200.000). Suponiendo una dosis de prueba negativa, se inyectará bupivacaína al 0,125 % de forma incremental hasta un nivel sensorial T10. La analgesia epidural se mantendrá con analgesia epidural controlada por el paciente (PCEA) (bupivacaína al 0,0625 % con fentanilo 1,95 microgramos/ml: infusión de fondo 15 ml/h, bolo de PCEA 5 ml, bloqueo 10 min, máximo 30 ml/h) según rutina. .

El estudio finaliza después del parto de la parturienta y se interrumpe la infusión epidural. En este momento se preguntará a la sujeto sobre su satisfacción con la analgesia del parto (escala de 100 mm, 0 mm = nada satisfecha, 100 mm = muy satisfecha).

Se recogerán los siguientes datos: edad materna, talla, peso, raza (autodescrito), dilatación cervical al inicio de la analgesia, tiempo y dilatación cervical al 2º pedido de analgesia, dosis máxima de oxitocina, tiempo hasta dilatación cervical completa (10 cm ), tiempo hasta el parto, modo de parto, peso neonatal, puntuaciones de Apgar y valores de gases en sangre umbilical (obtenidos como parte de la atención de rutina), dosis total de bupivacaína epidural y otros anestésicos locales, dosis total de fentanilo epidural, número de bolos de PCEA y número de bolos manuales (a cargo del anestesiólogo).

Los casos serán excluidos del análisis de datos si no se realiza analgesia CSE, si no hay analgesia (EVA > 10 mm) 10 minutos después de la inyección intratecal (fallo de la técnica CSE), si la dilatación cervical es de 8 cm dentro de los 60 minutos de la inyección intratecal , o si el paciente tiene un parto por cesárea. Estos casos serán denunciados.

Estudio 2: Las mujeres elegibles admitidas en la Unidad de trabajo de parto y parto del Prentice Women's Hospital para un parto por cesárea planificado serán contactadas para participar en el estudio inmediatamente después de la evaluación preanestésica de rutina. Esto ocurre poco después de la admisión a la Unidad de Labor y Parto. Las mujeres que acepten participar darán su consentimiento informado por escrito en este momento.

Se obtendrá sangre venosa para el análisis genético de la posición 118 del gen del receptor µ-opioide poco después de que el sujeto dé su consentimiento para participar en el estudio, ya sea a través de un catéter intravenoso colocado para el acceso intravenoso de rutina para el trabajo de parto y el parto, o a través de una venopunción fresca. Se recolectará un total de 10 ml de sangre en dos tubos con EDTA de 5 ml. Los tubos se dosificarán, codificarán y almacenarán en un refrigerador a 4oC hasta que se envíen (1 vez al mes) al laboratorio del Dr. J. L. Blouin, al cuidado del Dr. Landau, en los Hospitales Universitarios de Ginebra. El análisis genético se realizará como se describe a continuación. Se administrará profilaxis de aspiración de rutina (ranitidina y metoclopramida intravenosas, y antiácido oral). La anestesia espinal se iniciará en la posición sentada de la manera habitual con bupivacaína 12 mg (1,6 ml de bupivacaína hiperbárica al 0,75 %), fentanilo 15 µg y morfina 150 microgramos. Los sujetos se colocarán en posición de desplazamiento uterino izquierdo supino inmediatamente después de la inyección intratecal. El nivel de bloqueo sensorial cefálico se determinará 30 minutos después de la inyección intratecal utilizando cabellos de von Frye. Los sujetos con un nivel sensorial por debajo de T6, o aquellos que requieran suplementos de opioides sistémicos intraoperatorios, serán excluidos de la participación en estudios posteriores.

En la URPA y durante las 24 horas posteriores a la cirugía, los pacientes recibirán ibuprofeno 600 mg po cada 6 h según el protocolo estándar. Los pacientes pueden solicitar analgesia de rescate si experimentan molestias. La medicación de rescate consistirá en hidrocodona 10 mg más acetaminofén 325 mg por vía oral. Se administrará una dosis adicional de hidrocodona de 10 mg más acetaminofeno de 325 mg después de 1 hora si el dolor no se alivia. Estos son medicamentos analgésicos orales de rutina para la analgesia posoperatoria del parto por cesárea. Se escribirán órdenes estándar para monitorear la sedación y la frecuencia respiratoria, y el tratamiento de los efectos secundarios (náuseas, vómitos, prurito y depresión respiratoria).

La variable principal de resultado es la cantidad de analgesia equivalente a la morfina de rescate requerida durante las 24 horas posteriores a la inyección intratecal de morfina.18 Se anotará el momento de la primera solicitud de analgesia de rescate y se determinará la EVA en el momento de la solicitud de analgesia de rescate. Además, se le pedirá a la parturienta que proporcione una EVA para el dolor a las 4, 8, 12, 18 y 24 horas después de la inyección intratecal. Se determinará la presencia de prurito (ninguno, leve, moderado, severo), náuseas (ninguno, leve, moderado o severo) y vómitos (sí, no) a las 4 y 24 h después de la inyección intratecal.

El estudio finaliza 24 h después de la inyección intratecal. En este momento se preguntará al sujeto sobre su satisfacción con la analgesia postoperatoria (escala de 100 mm, 0 mm = nada satisfecho, 100 mm = muy satisfecho). El protocolo del estudio no dictará más analgesia.

Se recogerán los siguientes datos: edad materna, talla, peso, raza (autodescrito), requerimiento de sedación intraoperatoria suplementaria, peso neonatal, tratamiento intra o postoperatorio de prurito, náuseas o vómitos. Además del momento de la primera solicitud de analgesia oral suplementaria, se registrará lo siguiente: requerimientos de dosis de analgesia suplementaria (número de tabletas de paracetamol/hidrocodona) a las 4, 8, 12, 18 y 24 h después de la inyección intratecal.

Recolección de ADN: La sangre periférica se recolectará en 2 tubos EDTA de 5 ml (total 10 ml). El ADN se preparará mediante métodos no fenólicos utilizando el kit de extracción de sangre Puregene (Gentra, Minneapolis, MN) y se analizará el peso molecular en electroforesis en gel y la calidad de la pureza mediante una medida de densitometría óptica (proporción 260/280 nm).

Genotipado de SNP: para la identificación de la distribución alélica del SNP A118G, primero se amplificarán 20-60 ng de ADN de los individuos mediante PCR (en aparatos termocicladores equipados con un bloque de placa de microtitulación de 96 pocillos) utilizando cebadores diseñados en las proximidades de los SNP. . Luego, el SNP se genotipificará en productos amplificados mediante minisecuenciación (pirosecuenciación).

Pirosecuenciación: la PCR con cebadores específicos de cDNA (que abarcan un intrón en el ADN genómico), en la que el cebador directo se marca con biotina 5', se realiza en condiciones estándar y el producto se analiza mediante el método de pirosecuenciación. Brevemente, se diseña un cebador interno dos nucleótidos antes del sitio de mutación, de modo que las dos poblaciones de ARNm puedan analizarse cuantificando las cantidades relativas de cada alelo presente en el producto de la PCR. El ADN de sujetos normales y afectados se usa como control.

Los productos de la PCR se inmovilizan con Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) mediante una incubación de 15 min a 65 oC en un tampón que contiene Tris-HCl 10 mM, NaCl 2 M, EDTA 1 mM y Tween 20 al 0,1 %. A continuación, los productos de PCR se eliminan de la solución mediante separación magnética, se desnaturalizan con NaOH 0,5 M y se lavan con Tris-acetato 200 mM, MgAc2 50 mM. El ADN monocatenario restante se hibrida luego con el cebador interno de "secuenciación", calentando la mezcla a 80 °C y enfriándola lentamente a temperatura ambiente. Las siguientes mezclas de enzimas y sustratos se agregan automáticamente a cada pocillo y las reacciones continúan a 28 °C, mediante la adición secuencial de nucleótidos individuales en un orden predeterminado. Las alturas de los picos de luciferasa son proporcionales al número de incorporaciones de nucleótidos, que se ha demostrado que es muy cuantitativo (tasa de error del 5 %) en varios entornos experimentales.

Las muestras de ADN codificadas se almacenarán en el laboratorio del Dr. Blouin. No se realizará ninguna secuenciación adicional a menos que los sujetos firmen el formulario de consentimiento para estudios futuros adicionales.