Tocilitsumabin vaikutus solujen immuunivasteeseen influenssarokotteelle

Sisällyttämiskriteerit :

• RA-potilaat
• Yli 18-vuotiaana
• Tosilitsumabilla hoidettu vähintään 3 kuukautta

Poissulkemiskriteerit:

-munaallergia

Tutkimuksen suunnittelu:

- Potilaat ja kontrollihenkilöt rokotetaan kausi-influenssaa vastaan. Veri otetaan rokotuspäivänä ja 4 viikkoa sen jälkeen.

PBMC:n eristäminen PBMC:t eristetään heparinisoidusta laskimoverestä tiheysgradienttisentrifugoinnilla Lymphoprepilla (Axis-Shield, Oslo, Norja) välittömästi veren oton jälkeen. Solut lasketaan ja suspendoidaan RPMI 1640:een, jota on täydennetty lämpöinaktivoidulla 10 %:lla vasikan sikiön seerumia, penisilliiniä 100 U/ml, streptomysiiniä 0,1 mg/ml ja 2 mM L-glutamiinia (Biological Industries, Israel).

IFN-gamma-eritys PBMC-soluista IFN-gamma-erityksen tasot mitataan ELISA:lla PBMC-solujen supernatanteista, joita stimuloidaan joko influenssaantigeeniseoksella tai SEB:llä tai jätetään hoitamatta.

Grantsyymi B -aktiivisuusmääritys PBMC:itä viljellään 0,5 ml/kuoppa 48-kuoppaisilla levyillä (1,8 x 106 solua/kuoppa) ja stimuloidaan influenssaantigeeniseoksella ja SEB:llä, kuten edellä on kuvattu. Solut hajotetaan lyysipuskurissa (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1 % Triton x 100), sitten säilytetään

-760 astetta. Grantsyymi B -aktiivisuus mitataan Gijzen et ai. kuvaaman protokollan mukaisesti. [13]. Lyhyesti sanottuna pakastetut solulysaatit altistetaan kolmelle pakastus/sulatussyklille Granzyme B:n vapautumisen mahdollistamiseksi. Rekombinantti Granzyme B -standardit (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) ja solulysaatit lisätään kahtena rinnakkaisena 96-kuoppaiseen levy (20 µl/kuoppa). Reaktio alkaa, kun lisätään 80 μl substraattiliuosta, joka sisältää 400 μM Ac-IEPD-pNA-substraattia (Calbiochem, Darmstadt, Saksa) määrityspuskurissa (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (w/v), sakkaroosi, 0,1 % (w/v) CHAPS ja 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). Levy suljetaan, peitetään ja inkuboidaan pimeässä, kostutetussa kammiossa 370 C:ssa 20 tuntia. Inkuboinnin jälkeen levy luetaan 405 nm:ssä. Grantsyymi B -yksiköt lasketaan käyttämällä 4. asteen polynomikäyrää log (konsentraatio)-log (absorbanssi) -käyrällä, ja proteiinipitoisuudet korjataan BCA-proteiinimäärityksellä (Thermo Scientific, IL).

Humoraalinen vaste Vasta-ainevaste mitataan HI-testillä WHO:n standardimenettelyn mukaisesti, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Antiseerumin tiitteri, joka ei osoita mitään estoa, kirjataan 1/10. Humoraalinen vaste määritellään joko nelinkertaiseksi tai suuremmiksi HI-vasta-aineiden tiitterin nousuksi tai nousuksi ei-suojaavasta perustasosta (<1/40) 1/40:een. Vasta-aineiden geometriset keskimääräiset tiitterit lasketaan koko ryhmän immuniteetin arvioimiseksi.