Wirkung von Tocilizumab auf die zelluläre Immunantwort auf den Influenza-Impfstoff

Einschlusskriterien :

• RA-Patienten
• Ab 18 Jahren
• Mindestens 3 Monate mit Tocilizumab behandelt

Ausschlusskriterien:

-Ei-Allergie

Design der Studie:

- Patienten und Kontrollpersonen werden gegen saisonale Influenza geimpft. Am Tag der Impfung und 4 Wochen danach wird Blut abgenommen.

PBMC-Isolierung Die PBMCs werden aus heparinisiertem venösem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation auf Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norwegen) unmittelbar nach der Blutentnahme isoliert. Die Zellen werden gezählt und in RPMI 1640 suspendiert, ergänzt mit hitzeinaktiviertem 10 % fötalem Kälberserum, Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 0,1 mg/ml und 2 mM L-Glutamin (Biological Industries, Israel).

IFN-Gamma-Sekretion aus PBMCs Die IFN-Gamma-Sekretionsniveaus werden durch ELISA in den Überständen von PBMCs gemessen, die entweder mit einer Influenza-Antigenmischung oder mit SEB stimuliert werden oder unbehandelt bleiben.

Granzyme-B-Aktivitätsassay Die PBMCs werden mit 0,5 ml/Well in 48-Well-Platten (1,8 x 106 Zellen/Well) kultiviert und mit einem Influenza-Antigen-Mix und SEB wie oben beschrieben stimuliert. Die Zellen werden in Lysepuffer (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1 % Triton x100) lysiert und dann bei gelagert

-760 °C. Die Aktivität von Granzyme B wird gemäß dem von Gijzen et al. beschriebenen Protokoll gemessen. [13]. Kurz gesagt, gefrorene Zelllysate werden drei Einfrier-/Auftauzyklen unterzogen, um die Freisetzung von Granzyme B zu ermöglichen. Rekombinante Granzyme B-Standards (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) und Zelllysate werden in zweifacher Ausfertigung in ein 96-Well-Gerät gegeben Platte (20 µl/Well). Die Reaktion beginnt mit der Zugabe von 80 μl Substratlösung, die 400 μM Ac-IEPD-pNA-Substrat (Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) in Testpuffer (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (Gew./Vol.), Saccharose, 0,1) enthält % (w/v) CHAPS und 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). Die Platte wird versiegelt, abgedeckt und 20 Stunden lang in einer dunklen, feuchten Kammer bei 370 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die Platte bei 405 nm ausgelesen. Granzyme-B-Einheiten werden unter Verwendung einer Polynomkurve 4. Ordnung mit einem log (Konzentration)-log (Absorption)-Diagramm berechnet und durch den BCA-Proteintest (Thermo Scientific, IL) um Proteinkonzentrationen korrigiert.

Die humorale Reaktion Die Antikörperreaktion wird durch den HI-Test gemäß einem Standard-WHO-Verfahren gemessen, wie zuvor beschrieben [14]. Der Titer eines Antiserums, das keine Hemmung zeigt, wird mit 1/10 aufgezeichnet. Eine humorale Reaktion ist entweder als vierfacher oder stärkerer Anstieg des HI-Antikörpertiters oder als Anstieg von einem nicht schützenden Ausgangswert (<1/40) auf 1/40 definiert. Der geometrische Mittelwert der Antikörpertiter wird berechnet, um die Immunität der gesamten Gruppe zu beurteilen.