Effekt af Tocilizumab på det cellulære immunrespons på influenzavaccine

Inklusionskriterier:

• RA patienter
• Over 18 år
• Behandlet med tocilizumab i mindst 3 måneder

Eksklusionskriterier:

-ægallergi

Design af undersøgelsen:

- Patienter og kontroller vil blive vaccineret mod sæsonbestemt influenza. Der tages blod på vaccinationsdagen og 4 uger efter.

PBMC-isolering PBMC'erne vil blive isoleret fra hepariniseret venøst ​​blod ved tæthedsgradientcentrifugering på Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norge) umiddelbart efter blodudtagning. Cellerne vil blive talt og suspenderet i RPMI 1640 suppleret med varme-inaktiveret 10% føtalt kalveserum, penicillin 100U/ml, streptomycin 0,1 mg/ml og 2 mM L-glutamin (Biological Industries, Israel).

IFN-gamma-sekretion fra PBMC'er IFN-gamma-sekretionsniveauer vil blive målt ved ELISA i supernatanterne af PBMC'er, som vil blive stimuleret med enten en influenzaantigenblanding eller med SEB, eller efterladt ubehandlet.

Granzyme B-aktivitetsassay PBMC'erne vil blive dyrket ved 0,5 ml/brønd i 48-brøndsplader (1,8X106 celler/brønd) og stimuleret med en influenzaantigenblanding og SEB som beskrevet ovenfor. Cellerne vil blive lyseret i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1 % Triton x100) og derefter opbevaret ved

-760C. Granzyme B-aktivitet vil blive målt i overensstemmelse med protokollen beskrevet af Gijzen et al. [13]. Kort fortalt vil frosne cellelysater blive udsat for tre fryse/tø-cyklusser for at muliggøre frigivelsen af ​​Granzyme B. Rekombinante Granzyme B-standarder (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) og cellelysater vil blive tilsat i to eksemplarer til en 96-brønd plade (20 µl/brønd). Reaktionen starter ved tilsætning af 80 μl substratopløsning indeholdende 400 μM Ac-IEPD-pNA-substrat (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) i assaybuffer (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (vægt/volumen), saccharose, 0,1 % (vægt/volumen) CHAPS og 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). Pladen vil blive forseglet, dækket og inkuberet i et mørkt befugtet kammer ved 370C i 20 timer. Efter inkubation aflæses pladen ved 405 nm. Granzyme B-enheder vil blive beregnet ved hjælp af en 4. ordens polynominel kurve med et log (koncentration)-log (absorbans) plot og korrigeret for proteinkoncentrationer ved BCA-proteinassay (Thermo Scientific, IL).

Det humorale respons Antistofresponset vil blive målt ved HI-testen i henhold til en standard WHO-procedure som tidligere beskrevet [14]. Titeren af ​​et antiserum, der ikke viser nogen hæmning, vil blive registreret som 1/10. Humoral respons er defineret som enten en fire gange eller større stigning i titeren af ​​HI-antistoffer eller en stigning fra et ikke-beskyttende basislinjeniveau (<1/40) til 1/40. Geometriske middeltitre af antistoffer vil blive beregnet for at vurdere hele gruppens immunitet.