A tocilizumab hatása az influenza elleni védőoltásra adott sejtes immunválaszra

Bevételi kritériumok:

• RA betegek
• 18 éves kor felett
• Legalább 3 hónapig tocilizumabbal kezelték

Kizárási kritériumok:

- tojás allergia

A tanulmány kialakítása:

- A betegeket és a kontrollszemélyeket beoltják a szezonális influenza ellen. Az oltás napján és 4 héttel azután vért vesznek.

PBMC izolálás A PBMC-ket heparinizált vénás vérből izoláljuk sűrűséggradiens centrifugálással Lymphoprepen (Axis-Shield, Oslo, Norvégia) közvetlenül a vérvétel után. A sejteket megszámláljuk és RPMI 1640-ben szuszpendáljuk, amelyet hővel inaktivált 10%-os borjúmagzati szérummal, 100 U/ml penicillinnel, 0,1 mg/ml sztreptomicinnel és 2 mM L-glutaminnal (Biological Industries, Izrael) egészítünk ki.

IFN-gamma szekréció PBMC-kből Az IFN-gamma szekréció szintjét ELISA-val mérik az influenza antigénkeverékkel vagy SEB-vel stimulált, vagy kezeletlenül hagyott PBMC felülúszójában.

Granzyme B aktivitási vizsgálat A PBMC-ket 0,5 ml/lyuk mennyiségben tenyésztjük 48 lyukú lemezeken (1,8 x 106 sejt/lyuk), és influenza antigénkeverékkel és SEB-vel stimuláljuk a fent leírtak szerint. A sejteket lízispufferben (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1% Triton x100) lizáljuk, majd

-760 C. A Granzyme B aktivitást a Gijzen és munkatársai által leírt protokoll szerint mérjük. [13]. Röviden: a fagyasztott sejtlizátumokat három fagyasztási/olvadási ciklusnak vetjük alá, hogy lehetővé tegyük a Granzyme B felszabadulását. Rekombináns Granzyme B standardokat (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) és a sejtlizátumokat két példányban adjuk hozzá egy 96-lyukúhoz. lemez (20 µl/lyuk). A reakció 80 μl szubsztrát oldat hozzáadásával kezdődik, amely 400 μM Ac-IEPD-pNA szubsztrátot (Calbiochem, Darmstadt, Németország) tartalmaz vizsgálati pufferben (100 mM HEPES pH 7,5, 10% (w/v), szacharóz, 0,1). % (w/v) CHAPS és 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Izrael). A lemezt lezárjuk, lefedjük és sötét, párásított kamrában 370 C-on 20 órán át inkubáljuk. Az inkubálás után a lemezt 405 nm-en olvassuk le. A Granzyme B egységeket egy 4. rendű polinominális görbével számítjuk ki log (koncentráció)-log (abszorbancia) görbével, és korrigáljuk a fehérjekoncentrációkat a BCA fehérjevizsgálattal (Thermo Scientific, IL).

A humorális válasz Az antitestválaszt a HI teszttel mérjük a WHO szabványos eljárásának megfelelően, a korábban leírtak szerint [14]. A gátlást nem mutató antiszérum titerét 1/10-ként rögzítjük. A humorális választ a HI-antitestek titerének négyszeres vagy nagyobb emelkedéseként, vagy a nem protektív alapszintről (<1/40) 1/40-re történő emelkedésként határozzák meg. Az antitestek geometriai átlagos titereit kiszámítjuk, hogy értékeljük az egész csoport immunitását.