Effekt av Tocilizumab på det cellulära immunsvaret på influensavaccin

Inklusionskriterier :

• RA-patienter
• Över 18 år
• Behandlas med tocilizumab minst 3 månader

Exklusions kriterier:

-äggallergi

Utformningen av studien:

– Patienter och kontroller kommer att vaccineras mot säsongsinfluensa. Blod tas dagen för vaccinationen och 4 veckor efter.

PBMC-isolering PBMC:erna kommer att isoleras från hepariniserat venöst blod genom densitetsgradientcentrifugering på Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norge) omedelbart efter att blodet tagits. Cellerna kommer att räknas och suspenderas i RPMI 1640 kompletterat med värmeinaktiverat 10 % fetalt kalvserum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 0,1 mg/ml och 2 mM L-glutamin (Biological Industries, Israel).

IFN-gamma-utsöndring från PBMC IFN-gamma-sekretionsnivåer kommer att mätas med ELISA i supernatanterna av PBMC som kommer att stimuleras med antingen en influensaantigenblandning eller med SEB, eller lämnas obehandlad.

Granzyme B-aktivitetsanalys PBMC:erna kommer att odlas med 0,5 ml/brunn i 48-brunnars plattor (1,8X106 celler/brunn) och stimuleras med en influensaantigenblandning och SEB enligt beskrivningen ovan. Cellerna lyseras i lyseringsbuffert (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1 % Triton x100) och lagras sedan vid

-760C. Granzym B-aktivitet kommer att mätas enligt protokollet beskrivet av Gijzen et al. [13]. I korthet kommer frysta cellysat att utsättas för tre frys-/upptiningscykler för att möjliggöra frisättning av Granzyme B. Rekombinanta Granzyme B-standarder (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) och cellysat kommer att tillsättas i duplikat till en 96-brunn platta (20 µl/brunn). Reaktionen startar vid tillsats av 80 μl substratlösning innehållande 400 μM Ac-IEPD-pNA-substrat (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) i analysbuffert (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (vikt/volym), sackaros, 0,1 % (vikt/volym) CHAPS och 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). Plattan kommer att förseglas, täckas och inkuberas i en mörk fuktad kammare vid 370C i 20 timmar. Efter inkubation avläses plattan vid 405 nm. Granzyme B-enheter kommer att beräknas med hjälp av en polynomkurva av fjärde ordningen med en log (koncentration)-log (absorbans) plot, och korrigeras för proteinkoncentrationer med BCA-proteinanalysen (Thermo Scientific, IL).

Det humorala svaret Antikroppssvaret kommer att mätas med HI-testet enligt en standard WHO-procedur som tidigare beskrivits [14]. Titern för ett antiserum som inte visar någon hämning kommer att registreras som 1/10. Humoral respons definieras som antingen en fyrfaldig eller större ökning av titern för HI-antikroppar, eller en ökning från en icke-skyddande baslinjenivå (<1/40) till 1/40. Geometriska medeltitrar för antikroppar kommer att beräknas för att bedöma immuniteten för hela gruppen.