Влияние тоцилизумаба на клеточный иммунный ответ на вакцину против гриппа

Критерии включения :

• пациенты с РА
• старше 18 лет
• Лечение тоцилизумабом не менее 3 мес.

Критерий исключения:

-аллергия на яйца

Дизайн исследования:

- Пациенты и контрольная группа будут вакцинированы против сезонного гриппа. Кровь берут в день вакцинации и через 4 недели после нее.

Выделение РВМС РВМС выделяют из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности на Lymphoprep (Axis-Shield, Осло, Норвегия) сразу после забора крови. Клетки подсчитывают и суспендируют в среде RPMI 1640 с добавлением инактивированной нагреванием 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллина 100 ЕД/мл, стрептомицина 0,1 мг/мл и 2 мМ L-глютамина (Biological Industries, Israel).

Секреция IFN-гамма из PBMC Уровни секреции IFN-gamma будут измеряться с помощью ELISA в супернатантах PBMC, которые будут стимулированы либо смесью антигенов гриппа, либо SEB, либо оставлены без лечения.

Анализ активности гранзима В РВМС культивируют по 0,5 мл/лунку в 48-луночных планшетах (1,8×106 клеток/лунку) и стимулируют смесью антигенов гриппа и SEB, как описано выше. Клетки лизируют в лизирующем буфере (150 мМ NaCl, 15 мМ Трис, 1% Тритон x100), затем хранят при

-760С. Активность гранзима В будет измеряться в соответствии с протоколом, описанным Gijzen et al. [13]. Вкратце, замороженные клеточные лизаты будут подвергнуты трем циклам замораживания/оттаивания, чтобы обеспечить высвобождение Гранзима В. Стандарты рекомбинантного Гранзима В (Enzo Life Sciences International, Inc., Пенсильвания) и клеточные лизаты будут добавлены в двух экземплярах в 96-луночный планшет (20 мкл/лунка). Реакция начнется при добавлении 80 мкл раствора субстрата, содержащего 400 мкМ субстрата Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Дармштадт, Германия) в буфере для анализа (100 мМ HEPES, pH 7,5, 10% (масса/объем), сахароза, 0,1 % (мас./об.) CHAPS и 10 мМ DTT (Sigma Aldrich, Реховот, Израиль). Планшет запечатывают, накрывают и инкубируют в темной влажной камере при 37°С в течение 20 часов. После инкубации планшет будет считываться при 405 нм. Единицы гранзима В будут рассчитываться с использованием полиномиальной кривой 4-го порядка с графиком логарифм (концентрация)-логарифм (поглощение) и с поправкой на концентрацию белка с помощью анализа белка ВСА (Thermo Scientific, IL).

Гуморальный ответ. Ответ антител будет измеряться с помощью теста HI в соответствии со стандартной процедурой ВОЗ, как описано ранее [14]. Титр антисыворотки, не демонстрирующий никакого ингибирования, будет записан как 1/10. Гуморальный ответ определяется как четырехкратное или большее увеличение титра HI-антител, либо повышение с незащитного исходного уровня (<1/40) до 1/40). Средние геометрические титры антител будут рассчитаны для оценки иммунитета всей группы.