托珠单抗对流感疫苗细胞免疫反应的影响

纳入标准：

• 风湿性关节炎患者
• 18岁以上
• 接受托珠单抗治疗至少 3 个月

排除标准：

-鸡蛋过敏

研究设计：

- 患者和对照将接种季节性流感疫苗。 将在疫苗接种当天和 4 周后采集血液。

PBMC 分离在抽血后立即通过在 Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norway) 上进行密度梯度离心从肝素化静脉血中分离 PBMC。 细胞将被计数并悬浮在补充有热灭活的 10% 胎牛血清、青霉素 100U/ml、链霉素 0.1 mg/ml 和 2 mM L-谷氨酰胺（Biological Industries，Israel）的 RPMI 1640 中。

PBMC 的 IFN-γ 分泌 IFN-γ 分泌水平将通过 ELISA 在 PBMC 的上清液中测量，这些 PBMC 将用流感抗原混合物或用 SEB 刺激，或者不处理。

颗粒酶 B 活性测定 PBMC 将在 48 孔板（1.8X106 个细胞/孔）中以 0.5 ml/孔培养，并如上所述用流感抗原混合物和 SEB 刺激。 细胞将在裂解缓冲液（150mM NaCl、15mM Tris、1% Triton x100）中裂解，然后保存在

-760℃。 将根据 Gijzen 等人描述的方案测量颗粒酶 B 活性。 [13]. 简而言之，冷冻细胞裂解物将进行三个冷冻/解冻循环以释放粒酶 B。重组粒酶 B 标准品（Enzo Life Sciences International, Inc., PA）和细胞裂解物将一式两份添加到 96 孔板中板（20 微升/孔）。 反应将在加入 80 μl 底物溶液后开始，该溶液含有 400 μM Ac-IEPD-pNA 底物（Calbiochem，Darmstadt，德国），测定缓冲液（100mM HEPES pH 7.5、10%（w/v）、蔗糖、0.1 % (w/v) CHAPS 和 10 mM DTT（Sigma Aldrich，Rehovot，以色列）。 将板密封、覆盖并在黑暗的加湿室中在 370°C 下孵育 20 小时。 孵育后，将在 405 nm 处读取板。 使用具有对数（浓度）-对数（吸光度）图的四阶多项式曲线计算颗粒酶 B 单位，并通过 BCA 蛋白质测定法（Thermo Scientific，IL）针对蛋白质浓度进行校正。

体液反应 抗体反应将根据先前描述的标准 WHO 程序通过 HI 测试进行测量 [14]。 未显示任何抑制作用的抗血清的效价将记录为 1/10。 体液反应定义为 HI 抗体滴度升高四倍或更多，或从非保护性基线水平 (<1/40) 升高至 1/40)。 将计算抗体的几何平均滴度以评估整个组的免疫力。