Efecto de tocilizumab en la respuesta inmune celular a la vacuna contra la influenza

Criterios de inclusión :

• pacientes con AR
• Mayor de 18 años
• Tratado con tocilizumab al menos 3 meses

Criterio de exclusión:

-alergia al huevo

Diseño del estudio:

- Los pacientes y controles serán vacunados contra la influenza estacional. Se tomará sangre el día de la vacunación y 4 semanas después.

Aislamiento de PBMC Las PBMC se aislarán de sangre venosa heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad en Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Noruega) inmediatamente después de extraer la sangre. Las células se contarán y se suspenderán en RPMI 1640 complementado con suero de ternero fetal al 10% inactivado por calor, penicilina 100U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml y L-glutamina 2 mM (Biological Industries, Israel).

Secreción de IFN-gamma de PBMC Los niveles de secreción de IFN-gamma se medirán mediante ELISA en los sobrenadantes de PBMC que se estimularán con una mezcla de antígenos de influenza o con SEB, o se dejarán sin tratar.

Ensayo de actividad de granzima B Las PBMC se cultivarán a 0,5 ml/pocillo en placas de 48 pocillos (1,8X106 células/pocillo) y se estimularán con una mezcla de antígenos de la gripe y SEB como se describe anteriormente. Las células se lisarán en tampón de lisis (NaCl 150 mM, Tris 15 mM, Triton al 1% x 100), luego se almacenarán en

-760C. La actividad de granzima B se medirá de acuerdo con el protocolo descrito por Gijzen et al. [13]. Brevemente, los lisados ​​celulares congelados se someterán a tres ciclos de congelación/descongelación para permitir la liberación de Granzyme B. Los estándares de Granzyme B recombinante (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) y los lisados ​​​​celulares se agregarán por duplicado a un pozo de 96 placa (20 µl/pocillo). La reacción comenzará con la adición de 80 μl de solución de sustrato que contiene 400 μM de sustrato Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Darmstadt, Alemania) en tampón de ensayo (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (p/v), sacarosa, 0,1 % (p/v) de CHAPS y DTT 10 mM (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). La placa se sellará, tapará e incubará en una cámara húmeda oscura a 370C durante 20 h. Después de la incubación, la placa se leerá a 405 nm. Las unidades de granzima B se calcularán utilizando una curva polinómica de cuarto orden con una gráfica logarítmica (concentración) - logarítmica (absorbancia) y corregidas para las concentraciones de proteína mediante el ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, IL).

La respuesta humoral La respuesta de anticuerpos se medirá mediante la prueba HI de acuerdo con un procedimiento estándar de la OMS como se describió anteriormente [14]. El título de un antisuero que no muestre ninguna inhibición se registrará como 1/10. La respuesta humoral se define como un aumento de cuatro veces o más en el título de anticuerpos HI, o un aumento desde un nivel inicial no protector (<1/40) a 1/40). Se calcularán los títulos medios geométricos de anticuerpos para evaluar la inmunidad de todo el grupo.