Efeito do Tocilizumabe na Resposta Imune Celular à Vacina Influenza

Critério de inclusão :

• pacientes com AR
• Acima de 18 anos
• Tratado com tocilizumabe por pelo menos 3 meses

Critério de exclusão:

-alergia a ovo

Desenho do estudo:

- Pacientes e controles serão vacinados contra influenza sazonal. O sangue será coletado no dia da vacinação e 4 semanas depois.

Isolamento de PBMC As PBMCs serão isoladas de sangue venoso heparinizado por centrifugação de gradiente de densidade em Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Noruega) imediatamente após a coleta de sangue. As células serão contadas e suspensas em RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino 10% inativado pelo calor, penicilina 100U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml e L-glutamina 2 mM (Biological Industries, Israel).

Secreção de IFN-gama de PBMCs Os níveis de secreção de IFN-gama serão medidos por ELISA nos sobrenadantes de PBMCs que serão estimulados com uma mistura de antígenos influenza ou com SEB, ou deixados sem tratamento.

Ensaio de atividade da granzima B As PBMCs serão cultivadas a 0,5 ml/poço em placas de 48 poços (1,8X106 células/poço) e estimuladas com uma mistura de antígenos influenza e SEB conforme descrito acima. As células serão lisadas em tampão de lise (150mM NaCl, 15mM Tris, 1% Triton x100), então armazenadas em

-760C. A atividade da granzima B será medida de acordo com o protocolo descrito por Gijzen et al. [13]. Resumidamente, lisados ​​celulares congelados serão submetidos a três ciclos de congelamento/descongelamento para permitir a liberação de Granzima B. Padrões de Granzima B recombinante (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) e lisados ​​celulares serão adicionados em duplicata a um poço de 96 placa (20 µl/poço). A reação começará com a adição de 80 μl de solução de substrato contendo 400 μM de substrato Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Darmstadt, Alemanha) em tampão de ensaio (100mM HEPES pH 7,5, 10% (p/v), sacarose, 0,1 % (p/v) CHAPS e 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). A placa será selada, coberta e incubada em câmara umidificada escura a 370C por 20 h. Após a incubação, a placa será lida a 405 nm. As unidades de granzima B serão calculadas usando uma curva polinomial de 4ª ordem com um gráfico de log (concentração)-log (absorvância) e corrigidas para as concentrações de proteína pelo ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, IL).

A resposta humoral A resposta de anticorpos será medida pelo teste HI de acordo com um procedimento padrão da OMS conforme descrito anteriormente [14]. O título de um anti-soro que não apresenta nenhuma inibição será registrado como 1/10. A resposta humoral é definida como um aumento de quatro vezes ou mais no título de anticorpos HI, ou um aumento de um nível basal não protetor (<1/40) para 1/40). Os títulos médios geométricos de anticorpos serão calculados para avaliar a imunidade de todo o grupo.