Účinek tocilizumabu na buněčnou imunitní odpověď na vakcínu proti chřipce

Kritéria pro zařazení :

• pacientů s RA
• Ve věku nad 18 let
• Léčeno tocilizumabem minimálně 3 měsíce

Kritéria vyloučení:

- alergie na vejce

Design studie:

- Pacienti a kontroly budou očkováni proti sezónní chřipce. Krev bude odebrána v den očkování a 4 týdny poté.

Izolace PBMC PBMC budou izolovány z heparinizované žilní krve centrifugací s hustotním gradientem na Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norsko) ihned po odběru krve. Buňky se spočítají a suspendují v RPMI 1640 doplněném teplem inaktivovaným 10% fetálním telecím sérem, penicilinem 100 U/ml, streptomycinem 0,1 mg/ml a 2 mM L-glutaminem (Biological Industries, Izrael).

Sekrece IFN-gama z PBMC Hladiny sekrece IFN-gama budou měřeny pomocí ELISA v supernatantech PBMC, které budou stimulovány buď směsí chřipkových antigenů nebo SEB, nebo budou ponechány neošetřené.

Test aktivity Granzymu B PBMC budou kultivovány v množství 0,5 ml/jamka na 48jamkových destičkách (1,8X106 buněk/jamka) a stimulovány směsí chřipkových antigenů a SEB, jak je popsáno výše. Buňky budou lyžovány v lyzačním pufru (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1 % Triton x 100), poté uloženy při

-760 °C. Aktivita granzymu B bude měřena podle protokolu popsaného Gijzenem et al. [13]. Stručně řečeno, zmrazené buněčné lyzáty budou podrobeny třem cyklům zmrazení/rozmrazení, aby se umožnilo uvolnění Granzymu B. Rekombinantní standardy Granzymu B (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) a buněčné lyzáty budou přidány v duplikátech do 96jamkové destička (20 ul/jamka). Reakce začne po přidání 80 μl substrátového roztoku obsahujícího 400 μM substrátu Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Darmstadt, Německo) v testovacím pufru (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (w/v), sacharóza, 0,1 % (hm./obj.) CHAPS a 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Izrael). Destička se uzavře, přikryje a inkubuje v tmavé zvlhčené komoře při 370 °C po dobu 20 hodin. Po inkubaci se destička odečte při 405 nm. Jednotky granzymu B budou vypočteny pomocí polynominální křivky 4. řádu s log (koncentrace)-log (absorbance) grafem a korigovány na koncentrace proteinu pomocí BCA proteinového testu (Thermo Scientific, IL).

Humorální odpověď Protilátková odpověď bude měřena HI testem podle standardního postupu WHO, jak bylo popsáno dříve [14]. Titr antiséra nevykazujícího žádnou inhibici bude zaznamenán jako 1/10. Humorální odpověď je definována jako buď čtyřnásobné nebo větší zvýšení titru protilátek HI, nebo zvýšení z nechráněné základní úrovně (<1/40) na 1/40). Pro posouzení imunity celé skupiny budou vypočteny geometrické střední titry protilátek.