Effekt av tocilizumab på cellulær immunrespons på influensavaksine

Inklusjonskriterier :

• RA-pasienter
• Over 18 år
• Behandlet med tocilizumab i minst 3 måneder

Ekskluderingskriterier:

- eggallergi

Design av studien:

– Pasienter og kontroller skal vaksineres mot sesonginfluensa. Blod vil bli tatt på vaksinasjonsdagen og 4 uker etter.

PBMC-isolasjon PBMC-ene vil bli isolert fra heparinisert venøst ​​blod ved tetthetsgradientsentrifugering på Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norge) umiddelbart etter at blodet ble tatt. Cellene vil telles og suspenderes i RPMI 1640 supplert med varmeinaktivert 10 % føtalt kalveserum, penicillin 100U/ml, streptomycin 0,1 mg/ml og 2 mM L-glutamin (Biological Industries, Israel).

IFN-gamma-sekresjon fra PBMC-er IFN-gamma-sekresjonsnivåer vil bli målt ved ELISA i supernatantene til PBMC-er som vil bli stimulert med enten en influensaantigenblanding eller med SEB, eller stå ubehandlet.

Granzyme B-aktivitetsanalyse PBMC-ene vil bli dyrket med 0,5 ml/brønn i 48-brønners plater (1,8X106 celler/brønn) og stimulert med en influensaantigenblanding og SEB som beskrevet ovenfor. Cellene vil bli lysert i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1 % Triton x100), deretter lagret ved

-760C. Granzyme B-aktivitet vil bli målt i henhold til protokollen beskrevet av Gijzen et al. [1. 3]. Kort fortalt vil frosne cellelysater bli utsatt for tre fryse/tine-sykluser for å muliggjøre frigjøring av Granzyme B. Rekombinante Granzyme B-standarder (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) og cellelysater vil bli tilsatt i duplikat til en 96-brønn plate (20 ul/brønn). Reaksjonen starter ved tilsetning av 80 μl substratløsning som inneholder 400 μM Ac-IEPD-pNA-substrat (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) i analysebuffer (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (vekt/volum), sukrose, 0,1 % (vekt/volum) CHAPS og 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israel). Platen vil bli forseglet, dekket og inkubert i et mørkt fuktet kammer ved 370C i 20 timer. Etter inkubering vil platen avleses ved 405 nm. Granzyme B-enheter vil bli beregnet ved å bruke en 4. ordens polynominal kurve med et log (konsentrasjon)-log (absorbans) plott, og korrigert for proteinkonsentrasjoner ved hjelp av BCA-proteinanalysen (Thermo Scientific, IL).

Den humorale responsen Antistoffresponsen vil bli målt ved HI-testen i henhold til en standard WHO-prosedyre som tidligere beskrevet [14]. Titeren til et antiserum som ikke viser noen inhibering vil bli registrert som 1/10. Humoral respons er definert som enten en fire ganger eller større økning i titeren av HI-antistoffer, eller en økning fra et ikke-beskyttende baselinenivå (<1/40) til 1/40. Geometriske gjennomsnittstitre av antistoffer vil bli beregnet for å vurdere immuniteten til hele gruppen.