Effetto di Tocilizumab sulla risposta immunitaria cellulare al vaccino influenzale

Criterio di inclusione :

• Pazienti con AR
• Al di sopra dei 18 anni
• Trattata con tocilizumab per almeno 3 mesi

Criteri di esclusione:

-allergia all'uovo

Progettazione dello studio:

- Pazienti e controlli saranno vaccinati contro l'influenza stagionale. Il sangue verrà prelevato il giorno della vaccinazione e 4 settimane dopo.

Isolamento delle PBMC Le PBMC saranno isolate dal sangue venoso eparinizzato mediante centrifugazione in gradiente di densità su Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norvegia) immediatamente dopo il prelievo del sangue. Le cellule saranno contate e sospese in RPMI 1640 integrato con siero di vitello fetale al 10% inattivato al calore, penicillina 100 U/ml, streptomicina 0.1 mg/ml e 2 mM di L-glutammina (Biological Industries, Israel).

Secrezione di IFN-gamma da PBMC I livelli di secrezione di IFN-gamma saranno misurati mediante ELISA nei sopranatanti di PBMC che saranno stimolati con una miscela di antigeni influenzali o con SEB, o lasciati non trattati.

Saggio dell'attività del granzima B Le PBMC saranno coltivate a 0.5 ml/pozzetto in piastre da 48 pozzetti (1.8X106 cellule/pozzetto) e stimolate con una miscela di antigeni influenzali e SEB come descritto sopra. Le cellule saranno lisate in tampone di lisi (150mM NaCl, 15mM Tris, 1% Triton x100), quindi conservate a

-76°C. L'attività del granzima B sarà misurata secondo il protocollo descritto da Gijzen et al. [13]. In breve, i lisati cellulari congelati saranno sottoposti a tre cicli di congelamento/scongelamento per consentire il rilascio di Granzyme B. Gli standard di Granzyme B ricombinante (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) e i lisati cellulari verranno aggiunti in duplicato a 96 pozzetti piastra (20 µl/pozzetto). La reazione inizierà con l'aggiunta di 80 μl di soluzione di substrato contenente 400 μM di substrato Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Darmstadt, Germania) in tampone di analisi (100 mM HEPES pH 7,5, 10% (p/v), saccarosio, 0,1 % (p/v) CHAPS e 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israele). La piastra sarà sigillata, coperta e incubata in una camera buia umidificata a 370C per 20 h. Dopo l'incubazione, la piastra verrà letta a 405 nm. Le unità di Granzyme B saranno calcolate utilizzando una curva polinominale di 4° ordine con un grafico log (concentrazione)-log (assorbanza) e corrette per le concentrazioni proteiche mediante l'analisi proteica BCA (Thermo Scientific, IL).

La risposta umorale La risposta anticorpale sarà misurata mediante il test HI secondo una procedura standard dell'OMS come descritto in precedenza [14]. Il titolo di un antisiero che non mostra alcuna inibizione verrà registrato come 1/10. La risposta umorale è definita come un aumento quadruplo o maggiore del titolo di anticorpi HI o un aumento da un livello basale non protettivo (<1/40) a 1/40). Sarà calcolata la media geometrica dei titoli anticorpali per valutare l'immunità dell'intero gruppo.