Effect van Tocilizumab op de cellulaire immuunrespons op griepvaccin

Inclusiecriteria :

• RA-patiënten
• Boven de 18 jaar
• Minstens 3 maanden behandeld met tocilizumab

Uitsluitingscriteria:

- ei allergie

Ontwerp van de studie:

- Patiënten en controles worden gevaccineerd tegen seizoensgriep. Er wordt bloed afgenomen op de dag van vaccinatie en 4 weken erna.

PBMC-isolatie De PBMC's worden geïsoleerd uit gehepariniseerd veneus bloed door dichtheidsgradiëntcentrifugatie op Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Noorwegen) onmiddellijk nadat het bloed was afgenomen. De cellen zullen worden geteld en gesuspendeerd in RPMI 1640 aangevuld met door warmte geïnactiveerd 10% foetaal kalfsserum, penicilline 100 U/ml, streptomycine 0,1 mg/ml en 2 mM L-glutamine (Biological Industries, Israël).

IFN-gamma-secretie van PBMC's IFN-gamma-secretieniveaus zullen worden gemeten met ELISA in de supernatanten van PBMC's die zullen worden gestimuleerd met een mengsel van influenza-antigeen of met SEB, of onbehandeld blijven.

Granzyme B-activiteitsassay De PBMC's zullen worden gekweekt bij 0,5 ml/putje in platen met 48 putjes (1,8 x 106 cellen/putje) en gestimuleerd met een mengsel van influenza-antigeen en SEB zoals hierboven beschreven. De cellen worden gelyseerd in lysisbuffer (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1% Triton x100), daarna opgeslagen bij

-760C. Granzyme B-activiteit zal worden gemeten volgens het protocol beschreven door Gijzen et al. [13]. In het kort, ingevroren cellysaten zullen worden onderworpen aan drie cycli van invriezen/ontdooien om de afgifte van Granzyme B mogelijk te maken. Recombinante Granzyme B-standaarden (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) en cellysaten zullen in tweevoud worden toegevoegd aan een 96-well plaat (20 µl/putje). De reactie begint na de toevoeging van 80 μl substraatoplossing met 400 μM Ac-IEPD-pNA-substraat (Calbiochem, Darmstadt, Duitsland) in assaybuffer (100 mM HEPES pH 7,5, 10% (w/v), sucrose, 0,1 % (w/v) CHAPS en 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israël). De plaat wordt afgesloten, afgedekt en 20 uur in een donkere bevochtigde kamer bij 37°C geïncubeerd. Na incubatie wordt de plaat afgelezen bij 405 nm. Granzyme B-eenheden zullen worden berekend met behulp van een 4e orde polynominale kromme met een log (concentratie)-log (absorptie) plot, en gecorrigeerd voor eiwitconcentraties door de BCA-eiwitassay (Thermo Scientific, IL).

De humorale respons De antilichaamrespons wordt gemeten met de HI-test volgens een standaard WHO-procedure zoals eerder beschreven [14]. De titer van een antiserum dat geen remming vertoont, wordt geregistreerd als 1/10. Humorale respons wordt gedefinieerd als een viervoudige of grotere stijging van de titer van HI-antilichamen, of een stijging van een niet-beschermend basislijnniveau (<1/40) tot 1/40). Geometrisch gemiddelde titers van antilichamen worden berekend om de immuniteit van de hele groep te beoordelen.