Wpływ tocilizumabu na komórkową odpowiedź immunologiczną na szczepionkę przeciw grypie

Kryteria przyjęcia :

• pacjenci z RZS
• Powyżej 18 roku życia
• Leczenie tocilizumabem przez co najmniej 3 miesiące

Kryteria wyłączenia:

-alergia na jajka

Projekt badania:

- Pacjenci i grupa kontrolna zostaną zaszczepieni przeciwko grypie sezonowej. Krew zostanie pobrana w dniu szczepienia i 4 tygodnie po szczepieniu.

Izolacja PBMC PBMC zostaną wyizolowane z heparynizowanej krwi żylnej przez wirowanie w gradiencie gęstości na Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norwegia) natychmiast po pobraniu krwi. Komórki będą liczone i zawieszane w RPMI 1640 uzupełnionym inaktywowaną termicznie 10% płodową surowicą cielęcą, penicyliną 100 U/ml, streptomycyną 0,1 mg/ml i 2 mM L-glutaminą (Biological Industries, Izrael).

Wydzielanie IFN-gamma z PBMC Poziomy wydzielania IFN-gamma będą mierzone metodą ELISA w supernatantach PBMC, które będą stymulowane albo mieszaniną antygenów grypy albo SEB, albo pozostawione bez leczenia.

Test aktywności granzymu B PBMC będą hodowane w ilości 0,5 ml/dołek w 48-dołkowych płytkach (1,8 x 106 komórek/dołek) i stymulowane mieszanką antygenów grypy i SEB, jak opisano powyżej. Komórki zostaną poddane lizie w buforze do lizy (150 mM NaCl, 15 mM Tris, 1% Triton x 100), a następnie przechowywane w

-760C. Aktywność granzymu B będzie mierzona zgodnie z protokołem opisanym przez Gijzena i in. [13]. W skrócie, zamrożone lizaty komórkowe zostaną poddane trzem cyklom zamrażania/rozmrażania, aby umożliwić uwolnienie granzymu B. Standardy rekombinowanego granzymu B (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) i lizaty komórkowe zostaną dodane w dwóch powtórzeniach do 96-studzienkowej płytka (20 ul/dołek). Reakcja rozpocznie się po dodaniu 80 μl roztworu substratu zawierającego 400 μM substratu Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Darmstadt, Niemcy) w buforze testowym (100 mM HEPES pH 7,5, 10% (w/v), sacharoza, 0,1 % (wag./obj.) CHAPS i 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Izrael). Płytkę szczelnie zamknięto, przykryto i inkubowano w ciemnej, nawilżonej komorze w temperaturze 37°C przez 20 godzin. Po inkubacji płytka zostanie odczytana przy 405 nm. Jednostki granzymu B zostaną obliczone przy użyciu krzywej wielomianowej czwartego rzędu z wykresem log (stężenie)-log (absorbancja) i skorygowane o stężenia białka w teście białkowym BCA (Thermo Scientific, IL).

Odpowiedź humoralna Odpowiedź przeciwciał będzie mierzona za pomocą testu HI zgodnie ze standardową procedurą WHO, jak opisano wcześniej [14]. Miano surowicy odpornościowej niewykazującej żadnego hamowania zostanie zapisane jako 1/10. Odpowiedź humoralną definiuje się jako czterokrotny lub większy wzrost miana przeciwciał HI lub wzrost od nieochronnego poziomu wyjściowego (<1/40) do 1/40). W celu oceny odporności całej grupy zostaną obliczone średnie geometryczne mian przeciwciał.