Effet du tocilizumab sur la réponse immunitaire cellulaire au vaccin antigrippal

Critère d'intégration :

• Patients atteints de PR
• Plus de 18 ans
• Traité par tocilizumab au moins 3 mois

Critère d'exclusion:

- allergie aux oeufs

Conception de l'étude :

- Les patients et les témoins seront vaccinés contre la grippe saisonnière. Le sang sera prélevé le jour de la vaccination et 4 semaines après.

Isolement des PBMC Les PBMC seront isolées du sang veineux hépariné par centrifugation en gradient de densité sur Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Norvège) immédiatement après le prélèvement de sang. Les cellules seront comptées et mises en suspension dans du RPMI 1640 additionné de sérum de veau fœtal à 10 % inactivé par la chaleur, de pénicilline 100 U/ml, de streptomycine 0,1 mg/ml et de L-glutamine 2 mM (Biological Industries, Israël).

Sécrétion d'IFN-gamma à partir des PBMC Les niveaux de sécrétion d'IFN-gamma seront mesurés par ELISA dans les surnageants des PBMC qui seront stimulés soit avec un mélange d'antigènes grippaux, soit avec du SEB, ou laissés non traités.

Dosage de l'activité Granzyme B Les PBMC seront cultivées à 0,5 ml/puits dans des plaques de 48 puits (1,8 x 106 cellules/puits) et stimulées avec un mélange d'antigènes grippaux et de SEB comme décrit ci-dessus. Les cellules seront lysées dans du tampon de lyse (150mM NaCl, 15mM Tris, 1% Triton x100), puis conservées à

-760C. L'activité Granzyme B sera mesurée selon le protocole décrit par Gijzen et al. [13]. En bref, les lysats cellulaires congelés seront soumis à trois cycles de congélation/décongélation pour permettre la libération de Granzyme B. Les étalons de granzyme B recombinants (Enzo Life Sciences International, Inc., PA) et les lysats cellulaires seront ajoutés en double à un 96 puits plaque (20 µl/puits). La réaction commencera lors de l'ajout de 80 μl de solution de substrat contenant 400 μM de substrat Ac-IEPD-pNA (Calbiochem, Darmstadt, Allemagne) dans un tampon de dosage (100 mM HEPES pH 7,5, 10 % (p/v), saccharose, 0,1 % (w/v) CHAPS et 10 mM DTT (Sigma Aldrich, Rehovot, Israël). La plaque sera scellée, recouverte et incubée dans une chambre sombre humidifiée à 37°C pendant 20 h. Après incubation, la plaque sera lue à 405 nm. Les unités Granzyme B seront calculées à l'aide d'une courbe polynominale de 4ème ordre avec un tracé log (concentration)-log (absorbance) et corrigées pour les concentrations de protéines par le test de protéines BCA (Thermo Scientific, IL).

La réponse humorale La réponse anticorps sera mesurée par le test HI selon une procédure standard de l'OMS telle que décrite précédemment [14]. Le titre d'un antisérum ne montrant aucune inhibition sera noté 1/10. La réponse humorale est définie comme une multiplication par quatre ou plus du titre d'anticorps IH, ou une augmentation d'un niveau de base non protecteur (<1/40) à 1/40). Les titres moyens géométriques d'anticorps seront calculés pour évaluer l'immunité de l'ensemble du groupe.