P-elementin aiheuttaman Wimpy-kiveksen (Piwi) vuorovaikutuksessa olevan RNA-823:n (piR-823) epigeneettinen säätelyrooli munasarjasyövän etenemisessä

1. Johdanto Munasarjasyöpä (OC) on yksi aggressiivisimmista naisten kasvaimista maailmanlaajuisesti ja toiseksi yleisin pahanlaatuinen kasvain rintasyövän jälkeen. Egyptissä OC on neljänneksi yleisin naisten syöpä. Nykyiset hoidot tulevat tehottomiksi useiden hoitojaksojen jälkeen korkean uusiutumisprosentin vuoksi, joka on noin 80-85%. Siksi on kiireellisesti tutkittava uusia OC-hoidon kohteita [1]. OC edustaa sairauksien kirjoa, ei yhtä sairauskokonaisuutta. Piwin kanssa vuorovaikuttava RNA (piRNA) on yksijuosteinen ei-koodaava RNA (ncRNA), jonka nukleotidisekvenssi on 23-35 ja joka löydettiin nisäkkään sukusoluista. Siitä on tullut tähtimolekyyli ei-koodaavassa RNA-tutkimuksessa sen laajojen solusäätelytoimintojensa ansiosta [3]. Viime vuosina monet tutkimukset ovat osoittaneet, että piRNA osallistuu kasvainten esiintymiseen ja kehittymiseen monissa syöpityypeissä, kuten mahasyöpä, maksasyövä, keuhkosyöpä, rintasyöpä ja muut syövät [4]. piR-52207 ja piR-33733 osallistuvat OC-onkogeneesiin osallistumalla lukuisiin solujen signalointireitteihin transkription jälkeisellä tasolla [5]. PiRNA:iden kliininen merkitys ja biologiset mekanismit OC:n etenemisessä ovat kuitenkin suurelta osin tuntemattomia. piR-823 oli yksi ensimmäisistä piRNA:ista, joiden tunnistettiin liittyvän pahanlaatuisuuteen, ja se tunnistettiin valkosoluista, syöpäsolulinjoista ja veriplasmasta. piR-823:lla on yleissyöpä ilmentymiskuvio erityyppisissä syövissä, kuten maha-, paksusuolen-, rinta-, ruokatorvi-, maksa-, eturauhas- ja munuaissyövissä [6, 7]. Viime aikoina piRNA-823:n on dokumentoitu osallistuvan tuumorigeneesiin säätelemällä de novo DNA:n metylaatiota ja angiogeneesiä multippeli myeloomassa [3]. Niiden toiminnallisia mekanismeja ja epigeneettistä säätelyroolia OC:ssa ei kuitenkaan ole tutkittu. Näin ollen piR-823:n säätelevän roolin tutkiminen voisi tarjota tavan tutkia ncRNA:iden käyttöä prognostisena mekanismina OC:ssa, mikä muodostaa potentiaalisen kohteen. lääkekehitystä varten TUTKIMUSTAVOITE(T) Tutkia piR-823:n ilmentymistasoa OC-kudosnäytteissä. Osoita korrelaatio piR-823:n ja OC:n etenemisen välillä. Korreloi piR-823:n ja OC:n kliinisopatologiset ominaisuudet

2. Koehenkilöt 2.1 Tutkimuksen otoskoko ja teho Otoskoon laskenta perustuu (Jie Yin et al, 2017) aiempaan tutkimukseen. Näytteen koon estimointi G power* -otoskoon online-laskimella (http://www.gpower.hhu.de/en.html), riippuen kaksipuolisesta luottamustasosta 95 %. Otoskoko, jotta voidaan hylätä nollahypoteesi, jonka mukaan tutkittujen ryhmien populaatiokeskiarvot ovat yhtä suuret todennäköisyydellä (potenssilla) (0,95) ja tämän nollahypoteesin testiin liittyvällä tyypin I virhetodennäköisyydellä on (0,05).

   2.2 Tutkimuksen suunnittelu Tapauskontrolloitu retrospektiivinen havainnointitutkimus, yksikeskus. 2.3 Institutional Review Boardin (IRB) lausunto Ain Shams Universityn farmasian tiedekunnan tutkimuseettinen toimikunta myönsi tutkimuksen suorittamiseen eettisen luvan. Kaikki osallistujat (kontrollit tai potilaat) olivat täysin tietoisia tutkimuksen tarkoituksesta ja allekirjoittivat kirjallisen, eettisesti hyväksytyn, tietoon perustuvan suostumuslomakkeen (I·C). Tämä tutkimus tehtiin Helsingin vuonna 2013 hyväksytyn ohjeistuksen mukaisesti. 2.4 Tutkimukseen osallistuja 2.4.1 Potilasryhmä Tutkimukseen oli otettu yhteensä 39 naista, heidän ikähaitarinsa (13-75 vuotta), potilaita, joilla oli diagnosoitu primaarinen pahanlaatuinen munasarjakasvain. opiskella. OC-potilaat olivat aiemmin hoitamattomia egyptiläisten potilaiden kohorttia, jotka otettiin gynekologian ja synnytysosastolle tai onkologian osastolle, Ain Shams University Hospitals, Kairo, Egypti. Munasarjasyöpäkudosnäytteet kerättiin kirurgisen resektion aikana ja varmistettiin postoperatiivisilla patologisilla tutkimuksilla.

   2.4.2 Kontrolliryhmä Potilailta, joilla oli hyvänlaatuisia kohdun sairauksia, kuten myooma ja joille tehtiin kohdun ja munasarjojen resektio, kerättiin yhteensä 17 normaalia munasarjakudosnäytettä. Kontrollien ikähaarukka on 45-62 vuotta Potilasryhmälle (n = 39) kirjattiin koko historia. Potilas, joka oli mukana tutkimuksessa If täytti osallistumiskriteerit ja annettuaan suostumuksensa tutkimukseen osallistumiselle ja allekirjoitti tietoisen suostumuksen. Sisällyttämiskriteerit; Tämä tutkimus sisälsi äskettäin diagnosoituja, hoitamattomia histopatologisesti vahvistettujen OC-potilaiden tapauksia. poissulkemiskriteerit; Henkilöt, jotka saavat kemoterapiaa, sädehoitoa ja potilaat, joilla on ollut muuta syöpää kuin OC. Lisäksi henkilöt, joilla on riittämättömät tiedot tai puuttuvat histopatologiset diagnoosit.

   2.4.3. Potilaiden demografiset ja patologiset tiedot Potilaat olivat joko lisääntymis-, premenopausaalisessa tai postmenopausaalisessa vaiheessa. Potilaiden demografiset tiedot, mukaan lukien ikä, vaihdevuosien tila, askites ja potilaan koko historia, haettu Ain Shamsin sairaaloista kerätyistä potilaiden lääketieteellisistä tiedoista seuraavien tietojen alkuperäisten patologiaraporttien lisäksi (kasvainkohta, kasvaimen koko, kasvain tyyppi, imusolmukkeiden etäpesäke, kaukainen etäpesäke, kasvainvaihe ja kasvainaste) saatiin Ain Shams Hospitalsin patologian osastolta. OC-histologinen määritys tehty Kansainvälisen gynekologian ja synnytyslääkäriliiton (FIGO) kriteerien mukaisesti

3. menetelmät

3.1 in silico -analyysi Tietokantojen louhinta kohdistusreittien ja funktionaalisen rikastamisen analyysiä varten Sitoutumisvuorovaikutusennusteiden lisäksi 3.2 Kudosnäytteet Kontrolleista otettiin munasarjojen tuorekudosnäytteet ja OC-potilaille tehtiin leikkausleikkaus Ain shams -yliopiston synnytys- ja gynekologian laitoksella. Kaikki resektoidut kudosnäytteet säilytettiin -20 °C:ssa RNA:n stabilointireagenssin lisäämisen jälkeen (Qiagen, Hilden, Saksa). 3.3 RNA:n kokonaisuutto ja kvantifiointi käyttämällä miRNeasy Mini -sarjaa (Cat. nro 217004; Qiagen, Hilden, Saksa) valmistajan protokollan mukaisesti kudosnäytteistä tehtiin kokonais-RNA:n uutto. Eristetty RNA eluoitiin 40 µl:ssa RNaasi-vapaata vettä. Sitten eristetty RNA, joka kvantifioitiin käyttämällä NanoDrop® 1000 spektrofotometriä (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), kaikkien RNA-näytteiden pitoisuus ja puhtaus määritettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa erissä.

3.4 cDNA-synteesi ja piR-823:n ilmentymisen mittaaminen qRT-PCR:ää käyttäen Kokonais-RNA käänteiskopioidaan miSCRIPT Kitillä (Qiagen, Hilden, Saksa). Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin myöhemmin käyttämällä miRcury LNA SYBR Green PCR Kit -sarjaa (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Saatua cDNA:ta pidettiin -20 °C:ssa kvantifiointiin asti. qRT-PCR:ää käytettiin piR823:n ilmentymisen mittaamiseen käyttämällä miRCURY LNA miRNA:ta) käytettiin endogeenistä kontrollia 3,5 cDNA:n synteesiä ja mRNA:n ilmentymisen mittaamista qRT-PCR:llä RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) cDNA-synteesiä varten valmistusohjeiden mukaisesti. qRT-PCR valmistettu Power SYBR Green PCR Master Mix -tuotteella (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). GAPDH-aluketta käytettiin endogeenisenä kontrollina. RNA:n suhteellinen ilmentyminen laskettiin ja normalisoitiin kerta- muutoksena käyttämällä syklikynnys (Ct) -menetelmää (2--ΔΔCt).

3.6 Tilastollinen analyysi

• Tiedot kerätään, excel-taulukoitetaan ja testataan normaalisuuden suhteen Kolmogorov-Smirnov-testillä.
• Ikävaihteluiden ryhmien välisiä eroja verrataan χ2-testillä ja iän vaihtelun varianssianalyysillä. Monimuuttujalogistista regressiota, jossa on iän mukautuksia, käytetään osoittamaan valitun piR-823:n ilmentymisen ja OC-riskin välinen yhteys.
• Normaalisti jakautuneet muuttujat ilmaistaan ​​keskiarvona + (S.E.M) ja analysoidaan käyttämällä kahta näytteestä riippumatonta t-testiä. Mediaania (kvartiilien välinen alue) käytetään ei-parametristen tietojen ilmaisemiseen, ja se analysoidaan sen jälkeen Mann Whitney U -testillä.
• Kategoristen muuttujien erojen vertaamiseen käytettiin Pearsonin Chi-neliöanalyysiä tai Fisherin tarkkaa testiä.
• Kaikissa analyyseissa kaksisuuntaista P-arvoa 0,05 tai vähemmän pidetään tilastollisesti merkitsevänä