LA TECHNIQUE DE QUANTIFICATION DE L'ADN COMME OUTIL D'INTERPRÉTATION DANS LES MALADIES MITOCHONDRIALES

2622/5000 Les maladies mitochondriales (MM) sont les maladies métaboliques les plus courantes. Ces pathologies étant cliniquement très hétérogènes, seule la mise en évidence de mutations dans les gènes nucléaires ou l'ADN mitochondrial permet de confirmer le diagnostic.

L'étude grandeur nature de l'ADNmt par séquençage à haut débit (NGS) est une première étape dans la démarche diagnostique. L'introduction récente de cette nouvelle technologie révolutionnaire a considérablement augmenté l'efficacité de l'identification des mutations. Cependant, en plus des mutations pathogènes connues, le NGS révèle de nombreux variants dont la signification est actuellement inconnue. Un enjeu majeur pour obtenir un diagnostic fiable est donc l'interprétation de l'impact clinique de ces nouveaux variants rares qui s'avère très difficile.

Les critères de pathogénicité permettent de classer les variants de bénins à pathogènes. Un des critères majeurs de pathogénicité est une bonne corrélation du niveau hétéroplasmique avec l'atteinte tissulaire ou cellulaire. En effet, les mutations de l'ADNmt sont généralement hétéroplasmiques, ce qui correspond à la coexistence de molécules normales et mutées dans une même cellule ou tissu, les tissus les plus touchés ayant un taux de mutation élevé. Sur une biopsie musculaire d'un patient atteint, les fibres présentent souvent un déficit enzymatique en cytochrome c oxydase (COX-négatif) qui peut être mis en évidence en immunohistochimie. L'étude monofibre permet d'isoler les fibres déficientes et de quantifier le taux hétéroplasmique d'un variant. La présence d'un taux élevé d'hétéroplasme dans les fibres COX-négatives, contrairement aux fibres sans déficit, est un argument fort en faveur de la pathogénicité de ce variant. Actuellement, cette technique n'est pas utilisée en routine dans les laboratoires de diagnostic mais seulement occasionnellement dans un cadre de recherche dans certains laboratoires. C'est une technique lourde qui consiste en une première étape de microdissection laser des différentes fibres musculaires suivie d'une deuxième étape de quantification du variant de chaque fibre. Cette deuxième étape nécessite une attention particulière pour chaque variante identifiée.

Le but de cette étude pilote est de développer une nouvelle technique de quantification des hétéroplasmes monofibres isolés par microdissection laser NGS. Ceci, indépendamment du type de variante, évitera les ajustements longs et coûteux nécessaires à chaque nouvelle variante identifiée et facilitera ainsi son utilisation