LA TECNICA DI QUANTIFICAZIONE DEL DNA COME STRUMENTO DI INTERPRETAZIONE NELLE MALATTIE MITOCONDRIALI

2622/5000 Le malattie mitocondriali (MM) sono le malattie metaboliche più comuni. Poiché queste patologie sono molto eterogenee in termini clinici, solo l'identificazione di mutazioni nei geni nucleari o nel DNA mitocondriale conferma la diagnosi.

Lo studio su larga scala del mtDNA mediante sequenziamento ad alto rendimento (NGS) è un primo passo nell'approccio diagnostico. La recente introduzione di questa nuova tecnologia rivoluzionaria ha notevolmente aumentato l'efficienza dell'identificazione delle mutazioni. Tuttavia, oltre alle mutazioni patogene note, NGS rivela numerose varianti il ​​cui significato è attualmente sconosciuto. Una sfida importante per ottenere una diagnosi affidabile è quindi l'interpretazione dell'impatto clinico di queste nuove varianti rare che si rivela molto difficile.

I criteri di patogenicità consentono di classificare le varianti da benigne a patogene. Uno dei principali criteri di patogenicità è una buona correlazione del livello eteroplasmatico con il coinvolgimento tissutale o cellulare. In effetti, le mutazioni del mtDNA sono generalmente eteroplasmiche, il che corrisponde alla coesistenza di molecole normali e mutate nella stessa cellula o tessuto, i tessuti più colpiti hanno un alto tasso di mutazione. Su una biopsia muscolare di un paziente affetto, le fibre presentano spesso un deficit enzimatico nella citocromo c ossidasi (COX-negativo) che può essere dimostrato in immunoistochimica. Lo studio della singola fibra consente di isolare le fibre carenti e di quantificare il tasso eteroplasmico di una variante. La presenza di un alto livello di eteroplasma nelle fibre COX-negative, a differenza delle fibre senza deficit, è un forte argomento a favore della patogenicità di questa variante. Attualmente, questa tecnica non viene utilizzata di routine nei laboratori diagnostici, ma solo occasionalmente in un quadro di ricerca in alcuni laboratori. È una tecnica pesante che consiste in una prima fase di microdissezione laser delle varie fibre muscolari seguita da una seconda fase di quantificazione della variante da ciascuna fibra. Questa seconda fase richiede un focus specifico per ogni variante individuata.

Lo scopo di questo studio pilota è sviluppare una nuova tecnica per la quantificazione di eteroplasmi a fibra singola isolati mediante microdissezione laser NGS. Questo, indipendentemente dal tipo di variante, eviterà i lunghi e costosi adeguamenti richiesti per ogni nuova variante individuata e quindi ne faciliterà l'utilizzo