МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК КАК ИНСТРУМЕНТ ИНТЕРПРЕТАЦИИ ПРИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

2622/5000 Митохондриальные заболевания (ММ) являются наиболее распространенными метаболическими заболеваниями. Поскольку эти патологии очень неоднородны в клиническом отношении, диагноз подтверждается только выявлением мутаций в ядерных генах или митохондриальной ДНК.

Полномасштабное исследование мтДНК методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) является первым шагом в диагностическом подходе. Недавнее внедрение этой революционной новой технологии значительно повысило эффективность идентификации мутаций. Однако, помимо известных патогенных мутаций, NGS выявляет множество вариантов, значение которых в настоящее время неизвестно. Поэтому серьезной проблемой для получения надежного диагноза является интерпретация клинического воздействия этих новых редких вариантов, что оказывается очень трудным.

Критерии патогенности позволяют классифицировать варианты от доброкачественных до патогенных. Одним из основных критериев патогенности является хорошая корреляция гетероплазматического уровня с тканевым или клеточным поражением. Действительно, мутации мтДНК, как правило, являются гетероплазматическими, что соответствует сосуществованию нормальных и мутантных молекул в одной и той же клетке или ткани, при этом в наиболее пораженных тканях наблюдается высокая частота мутаций. При биопсии мышц пораженного пациента в волокнах часто обнаруживается дефицит фермента цитохром-с-оксидазы (ЦОГ-отрицательный), что может быть продемонстрировано с помощью иммуногистохимии. Исследование отдельных волокон позволяет изолировать дефектные волокна и количественно оценить гетероплазматический уровень варианта. Наличие высокого уровня гетероплазмы в ЦОГ-негативных волокнах, в отличие от волокон без дефицита, является веским аргументом в пользу патогенности этого варианта. В настоящее время этот метод не используется рутинно в диагностических лабораториях, а только изредка в рамках исследований в некоторых лабораториях. Это сложная техника, состоящая из первого этапа лазерной микродиссекции различных мышечных волокон, за которым следует второй этап количественного определения варианта каждого волокна. Этот второй шаг требует особого внимания к каждому выявленному варианту.

Целью этого экспериментального исследования является разработка нового метода количественного определения одноволоконных гетероплазм, выделенных с помощью лазерной микродиссекции NGS. Это, независимо от типа варианта, позволит избежать длительных и дорогостоящих корректировок, необходимых для каждого нового идентифицированного варианта, и, таким образом, облегчит его использование.