Rôle de l'activation des neutrophiles dans l'anaphylaxie aux agents bloquants neuromusculaires (NASA)

Étude cas-témoin, avec un suivi de 6,10 semaines sur les cas

Sélection de cas :

Critères d'inclusion : Tout patient âgé de 18 ans et plus :

Présentant des signes cliniques compatibles avec une réaction anaphylactique périopératoire aux médicaments bloquants neuromusculaires, quel que soit le grade de la réaction anaphylactique Traitée selon les recommandations françaises de prise en charge des patients 2011 (cf. annexe 5) Critères de non inclusion : patient décédé lors du choc anaphylactique

Sélection des contrôles : Un contrôle pour chaque cas sera inclus. Les témoins seront recrutés uniquement à l'Hôpital BICHAT. Les contrôles doivent correspondre aux éléments suivants :

Critères d'inclusion : Tout patient âgé de 18 ans et plus Hospitalisé pour une intervention chirurgicale nécessitant une injection de médicament bloquant neuromusculaire, sans développer de réaction anaphylactique Ayant été informé des particularités de l'étude et ayant consenti à participer à cette étude

Critères de non inclusion : femmes enceintes NB : Si un patient recruté comme témoin souffre d'une réaction anaphylactique suite à l'injection d'un médicament bloquant neuromusculaire, ce patient sera considéré comme un cas, et les autres témoins appariés, un à ce nouveau cas et un à l'original cas patient.

Jumelage : Les témoins seront jumelés aux cas en fonction des critères suivants :

- âge :+/- 5 ans

• sexe
• statut infectieux : infecté/ non infecté
• type de chirurgie : les différentes sous-classes sont classées comme suit : orthopédique, neurochirurgie/viscérale, urologique, gynécologique/vasculaire, cardiaque, thoraco/maxillo-faciale, ophtalmologie, ORL/Autre.
• Classe pharmacologique du médicament bloquant neuromusculaire utilisé pour la chirurgie

Durée de l'étude : Durée totale : 26 mois Période d'inclusion : 24 mois

Durée de participation pour un patient :

Cas : 6 à 10 semaines Témoins : le jour de la chirurgie

Prélèvement des échantillons Cas : au moment du choc (prélèvement de sang et de plasma, et, si nécessaire pour le patient, liquide d'aspiration bronchique) et lors de la consultation d'allergologie Anesthésie 6 à 10 semaines après la réaction anaphylactique Témoins : prélèvement de sang et de plasma après l'injection de l'injection de médicaments bloquants neuromusculaires.

Tous les prélèvements sanguins (et éventuellement l'aspiration des fluides bronchiques) nécessaires à cette étude sont effectués dans le cadre de la prise en charge clinique normale des patients cas et témoins, sans aucune procédure supplémentaire ou non conventionnelle d'intervention, de diagnostic ou de suivi des patients (étude non interventionnelle) . Des tubes sanguins surnuméraires sont prélevés en plus de ceux prélevés lors de la pratique clinique normale (10 ml sur tube sec pour sérum/plasma et 10 ml sur tube EDTA) en même temps (cas et témoins) et le liquide d'aspiration bronchique est conservé pour analyse au lieu d'être jeté.

Un choc anaphylactique au médicament bloquant neuromusculaire pendant l'anesthésie survient dans les minutes qui suivent l'injection/la perfusion. Les échantillons des patients cas seront donc prélevés dans les 30 à 60 minutes suivant l'injection/perfusion du médicament bloquant neuromusculaire, tel qu'il est déjà pratiqué actuellement pendant la chirurgie, et lorsque l'état du patient est stabilisé. Les enquêteurs s'attendent à ce que les incisions chirurgicales ne soient pas pratiquées chez la plupart des patients, sinon tous, car les réactions anaphylactiques se produisent avant que les incisions ne soient possibles, c'est-à-dire juste après l'injection/perfusion du médicament bloquant neuromusculaire. Des échantillons de patients témoins seront donc prélevés peu de temps après l'exposition au médicament bloquant neuromusculaire et avant la réalisation des incisions chirurgicales, afin d'éviter les perturbations induites par cet acte chirurgical, notamment en ce qui concerne l'activation des neutrophiles.

Volume sanguin prélevé spécifiquement pour cette étude :

• cas patient : 10 ml après la réaction anaphylactique, et lors de la consultation d'Allergologie-Anesthésie 6 à 10 semaines après le choc le choc.
• Patients témoins : 20 ml suite à l'injection du médicament bloquant neuromusculaire Les échantillons prélevés dans de l'héparinate de lithium pour l'étude cellulaire seront envoyés le jour de la réaction anaphylactique et le jour de la consultation d'allergologie-anesthésie par un service de livraison autorisé à l'Unité d'allergologie moléculaire et Cellulariser à l'Institut Pasteur.

Les échantillons prélevés sur tubes secs (échantillon de sérum) seront conservés au sero-tec de l'Hôpital BICHAT, et des séries d'aliquotes envoyées à l'Institut Pasteur sur demande. Des aliquotes identiques seront utilisées pour doser les IgG spécifiques anti-ammonium quaternaire et les IgE spécifiques comme cela est actuellement effectué à l'Unité d'Immunologie Autoimmunité et Hypersensibilité de l'Hôpital BICHAT.

Lorsqu'ils sont effectués, les fluides d'aspiration bronchique seront conservés en partie pour l'étude des TNE dans l'Unité d'Immunologie Autoimmunité et Hypersensibilité à l'Hôpital BICHAT, et en partie pour l'analyse du contenu cellulaire et des niveaux de PAF à l'Institut Pasteur, et en conséquence délivrés les mêmes jour dans les laboratoires respectifs.

Des prick-tests cutanés seront effectués lors de la consultation d'Allergologie-Anesthésie 6 à 10 semaines après la réaction anaphylactique.

Suite à chaque inclusion, chaque hôpital transmettra, selon les pratiques médicales courantes, des informations sur le patient : âge, sexe, type d'intervention chirurgicale qui était envisagée, nature des anesthésiques utilisés, antécédents d'événements atopiques dont asthme, allergie alimentaire ou médicamenteuse, facteurs de comorbidité. Les patients témoins seront inclus à l'hôpital BICHAT uniquement.

Principaux critères de jugement :

1. Pourcentage de neutrophiles activés circulants dans le groupe de patients immédiatement après un choc induit par le médicament bloquant neuromusculaire (cas) par rapport à celui du groupe de patients exposés au médicament bloquant neuromusculaire pendant l'anesthésie sans développer de choc (témoin). Cette mesure sera basée sur l'intensité d'expression du marqueur d'activation CD62L (L-sélectine) par les neutrophiles sanguins en utilisant la cytométrie en flux. Nos données préliminaires indiquent que l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) de CD62L est > 450 lorsque l'on considère les neutrophiles « non activés », et CD62L(MFI) < 300 lorsque l'on considère les neutrophiles « activés ».
2. Niveaux de PAF dans le plasma des "cas" que dans le plasma des "témoins".

Critères de jugement secondaires :

1. Taux d'IgG spécifiques anti-ammonium quaternaire dans le plasma des "cas" que dans le plasma des "témoins".
2. Capacité d'activation ex vivo des neutrophiles sanguins en présence de complexes immuns bloquants neuromusculaires-IgG

3. Présence de pièges extracellulaires de neutrophiles dans le liquide d'aspiration bronchique des "cas"

   Description de la population de patients : Une description complète de l'ensemble de la population étudiée et des groupes sera réalisée. Les variables seront décrites selon leur distribution le cas échéant (moyenne et écart-type pour les variables à distribution normale ; médiane et écart interquartile pour les variables à distribution anormale ; fréquence et pourcentage pour les critères de catégorie).

   Analyse - La distribution des variables représentant le pourcentage de neutrophiles activés entre les cas et les témoins, ainsi que chacun des critères de jugement secondaires seront comparés à l'aide d'une régression logique conditionnelle, en s'ajustant sur les critères d'appariement - Pour évaluer la corrélation entre le pourcentage de neutrophiles activés et la sévérité du choc, ou entre le niveau d'IgG spécifique et la sévérité du choc, un test de tendance linéaire dans un modèle linéaire général sera réalisé.

   • Une analyse des résultats obtenus dans des sous-groupes de patients définis en fonction de la sévérité du choc subi, sera également réalisée
   • Les tests statistiques seront bilatéraux et le risque de premier degré sera fixé à 5 %.

   • Description des paramètres fonctionnels des neutrophiles sanguins au stade basal ou après stimulation par des complexes bloquants neuromusculaires-IgG (expression de FcR et de marqueurs d'activation, libération de médiateurs, induction de NET), et description des paramètres immunologiques "classiques" du choc anaphylactique aux médicaments bloquants neuromusculaires (résultats des prick-tests, potentiel d'activation ex vivo des basophiles).

     5 études complémentaires seront réalisées sur des échantillons de patients inclus dans l'étude NASA :

   • IPAAQ (Identification et effets pathologiques des anticorps anti-ammonium quaternaire), Comme il faudra un échantillon supplémentaire de 10 ml de sérums, un consentement spécifique signé sera obtenu de chaque patient inclus dans l'étude IPAAQ. Cet échantillon de sérum sera prélevé lors de la visite d'allergologie prévue 6 à 10 semaines après le choc anaphylactique.

   L'objectif de cette étude est de quantifier, identifier et purifier les différentes sous-classes IgG d'anticorps anti-ammonium quaternaire dans les sérums de patients ayant subi un choc anaphylactique au cours d'une anesthésie. La capacité des complexes immuns, composés d'anticorps anti-ammonium quaternaire et d'un agent bloquant neuromusculaire, à se lier aux récepteurs IgG humains et/ou à activer les neutrophiles et basophiles humains in vitro sera évaluée. Cette analyse permettra de déterminer si les complexes IgG anti-ammonium quaternaire-agent bloquant neuromusculaire peuvent être pathogènes, et de valider le test diagnostique IgG anti-ammonium quaternaire, en plus du test IgE anti-ammonium quaternaire réalisé dans le cadre de la pratique clinique normale.

   • NASAmAbs : Différentes populations de lymphocytes B mémoire (notamment IgG ou IgE+) dirigées contre un ammonium quaternaire seront isolées à partir des PBMC de deux "cas" ayant accepté de participer à l'étude NASAmAbs, par cytométrie en flux à l'aide d'un Ammonium Quaternaire (QA) couplé à une protéine fluorescente (par exemple KLH). Les gènes codant pour les domaines variables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines (IgH et IgL) exprimés par chaque cellule B seront d'abord amplifiés par RT-PCR, puis clonés dans des vecteurs codant pour les domaines constants des immunoglobulines. Ces vecteurs seront transfectés dans des lignées cellulaires et les anticorps monoclonaux recombinants résultants (chimère humain-souris) seront produits et caractérisés en termes de réactivité spécifique contre les agents bloquants neuromusculaires QA (pour ELISA), d'affinité pour le ligand (par méthode de résonance magnétique ), et poly et auto-réactivité (par ELISA et immunofluorescence indirecte). L'anticorps recombinant sera évalué pour sa capacité à activer des cellules in vitro en présence d'antigène (QA ou NMBA) et quant à sa capacité à induire un choc anaphylactique in vivo, dans des modèles de souris transgéniques exprimant le récepteur humain de l'anticorps.

   L'objectif de ce projet est de générer des anticorps recombinants humains anti-ammonium quaternaire pour évaluer leur potentiel pathologique (anaphylactogène).

   Dans le cadre de l'étude NASAmAbs, 1 poche supplémentaire de 250ml de sang EDTA sera prélevée soit lors d'une consultation chez l'allergologue soit lors d'une visite prévue à cet effet.

   - NASA LYMPHAQ : La présence de lymphocytes T spécifiques des allergènes médicamenteux est documentée dans l'allergie à la pénicilline, mais leur présence et leurs caractéristiques dans l'allergie immédiate aux myorelaxants n'ont pas été décrites. Le but de notre étude ancillaire est de mettre en évidence ces lymphocytes T par des tests d'activation spécifiques, de caractériser phénotypiquement, de quantifier, et de comparer leur fréquence à celle de donneurs sains.

   Le but de cette étude ancillaire est d'identifier des populations de lymphocytes T spécifiques pour l'ammonium quaternaire chez les patients sensibles au NMBA.

   La recherche sera effectuée sur des cellules mononucléaires déjà isolées lors de la visite post-choc dans le cadre de l'étude de la NASA.

   • NASA Quin : Dans une étude récente, l'équipe du Dr ROUZAIRE a révélé une forte prévalence de sensibilisation aux bloqueurs neuromusculaires chez 17 patients allergiques aux quinolones : 53 % versus 3,4 % dans une population témoin. Comme pour la pholcodine, les quinolones pourraient donc être une voie de sensibilisation des bloqueurs neuromusculaires.

   L'objectif de ce projet annexe est de confirmer sur une cohorte plus large, l'association de sensibilisation entre ces deux classes de médicaments, les bloqueurs neuromusculaires et les quinolones.

   Dans le cadre de l'étude NASAQuin, aucun échantillon sanguin supplémentaire ne sera prélevé. La recherche sera effectuée sur des aliquotes de sérum et/ou de plasma conservés dans le cadre de l'étude NASA. Une aliquote de 300 µl sera utilisée pour le dosage.

   • NASA-CAT : L'anaphylaxie peut provoquer seule ou lors de l'administration d'adrénaline, des maladies cardiaques. L'amplitude, la fréquence et la physiopathologie des atteintes myocardiques sont inconnues.

   L'étude ancillaire "NASA-CAT" a pour objectif de définir, à l'aide de biomarqueurs plasmatiques myocardiques établis, la prévalence de la lésion myocardique au cours de l'anaphylaxie liée aux agents anesthésiques et le rôle de l'adrénaline dans cette lésion. L'adrénaline est une catécholamine qu'il est recommandé d'administrer par voie intraveineuse en cas d'anaphylaxie sévère. L'adrénaline permet de rétablir immédiatement la tension artérielle grâce à ses propriétés vasoconstrictrices. Des effets délétères de l'adrénaline sur les coronaires et le myocarde ont été décrits dans l'insuffisance cardiaque aiguë. L'existence d'effets similaires dans l'anaphylaxie n'est pas connue.

   Le but de l'étude "NASA-CAT" est d'évaluer l'implication du myocarde dans l'anaphylaxie et de déterminer le rôle de l'adrénaline dans cette lésion.

   Dans le cadre de l'étude ancillaire "NASA-CAT", aucun échantillon sanguin supplémentaire ne sera prélevé. Le dosage des biomarqueurs myocardiques (troponine hypersensible, peptides natriurétiques, adrénomédulline, copeptine) sera effectué sur des échantillons de 500μl de sérum et/ou plasma conservés dans le cadre de l'étude NASA.