Ruolo dell'attivazione dei neutrofili nell'anafilassi agli agenti bloccanti neuromuscolari (NASA)

Studio caso controllo, con un follow-up sui casi di 6,10 settimane

Selezione dei casi:

Criteri di inclusione: Qualsiasi paziente di età pari o superiore a 18 anni:

Presentare segni clinici compatibili con una reazione anafilattica perioperatoria ai farmaci bloccanti neuromuscolari, qualunque sia il grado della reazione anafilattica Trattata seguendo le linee guida French Patient Management 2011 (cfr. allegato 5) Criteri di non inclusione: paziente deceduto durante lo shock anafilattico

Selezione dei controlli: sarà incluso un controllo per ogni caso. I controlli saranno reclutati esclusivamente presso l'Ospedale BICHAT. I controlli dovrebbero corrispondere a quanto segue:

Criteri di inclusione: qualsiasi paziente di età pari o superiore a 18 anni ricoverato in ospedale per un intervento chirurgico che richiedeva un'iniezione di farmaco bloccante neuromuscolare, senza sviluppare una reazione anafilattica che fosse stato informato dei dettagli dello studio e che avesse acconsentito a partecipare a questo studio

Criteri di non inclusione: donne in gravidanza NB: se un paziente reclutato come controllo soffre di una reazione anafilattica in seguito all'iniezione di farmaci bloccanti neuromuscolari, questo paziente sarà considerato un caso e altri controlli accoppiati, uno a questo nuovo caso e uno all'originale caso paziente.

Accoppiamento: i controlli verranno accoppiati ai casi in base ai seguenti criteri:

- età: +/- 5 anni

• sesso
• stato infettivo: infetto/non infetto
• tipo di chirurgia: le diverse sottoclassi sono classificate come segue: ortopedico, neurochirurgico/viscerale, urologico, ginecologico/vascolare, cardiaco, toraco/maxillo-facciale, oftalmologico, ORL/Altro.
• Classe farmacologica del farmaco bloccante neuromuscolare utilizzato in chirurgia

Durata dello studio: Durata totale: 26 mesi Periodo di inclusione: 24 mesi

Durata della partecipazione per un paziente:

Casi: da 6 a 10 settimane Controlli: il giorno dell'intervento

Prelievo del campione Casi: al momento dello shock (campione di sangue e plasma e, quando necessario per il paziente, liquido di aspirazione bronchiale) e durante l'Allergologia Consultazione anestesiologica da 6 a 10 settimane dopo la reazione anafilattica Controlli: campione di sangue e plasma dopo l'iniezione dell'iniezione di farmaci bloccanti neuromuscolari.

Tutti i prelievi di sangue (ed eventualmente l'aspirazione dei fluidi bronchiali) necessari per questo studio vengono eseguiti durante la normale gestione clinica del caso e dei pazienti di controllo, senza alcuna procedura aggiuntiva o non convenzionale di intervento, diagnosi o monitoraggio del paziente (studio non interventistico) . Vengono raccolte contemporaneamente provette di sangue in sovrannumero rispetto a quelle raccolte durante la normale pratica clinica (10 ml su provetta asciutta per siero/plasma e 10 ml su provetta EDTA) (caso e controlli) e il liquido di aspirazione bronchiale viene conservato per analisi invece di essere scartato.

Uno shock anafilattico da farmaco bloccante neuromuscolare durante l'anestesia si verifica pochi minuti dopo l'iniezione/perfusione. I campioni dei pazienti casi saranno quindi raccolti nei 30-60 minuti successivi all'iniezione/perfusione del farmaco bloccante neuromuscolare, come già avviene attualmente durante l'intervento chirurgico, e quando le condizioni del paziente si sono stabilizzate. I ricercatori si aspettano che le incisioni chirurgiche non vengano eseguite nella maggior parte dei casi, se non in tutti, poiché le reazioni anafilattiche si verificano prima che le incisioni siano possibili, cioè subito dopo l'iniezione/perfusione del farmaco bloccante neuromuscolare. I campioni dei pazienti di controllo saranno quindi raccolti poco dopo l'esposizione al farmaco bloccante neuromuscolare e prima che vengano eseguite incisioni chirurgiche, per evitare le perturbazioni indotte da questo atto chirurgico, in particolare per quanto riguarda l'attivazione dei neutrofili

Volume di sangue raccolto appositamente per questo studio:

• caso paziente: 10 ml dopo la reazione anafilattica, e durante il consulto di Allergologia-Anestesia da 6 a 10 settimane dopo lo shock le choc.
• Pazienti di controllo: 20 ml dopo l'iniezione del farmaco bloccante neuromuscolare I campioni raccolti in Litio eparinato per lo studio cellulare verranno inviati il ​​giorno della reazione anafilattica e il giorno del consulto di Allergologia-Anestesia da un servizio di consegna autorizzato all'Unità Allergologic molecolare et Cellularise all'Istituto Pasteur.

I campioni raccolti su provette asciutte (campione di siero) saranno alloggiati nel sero-tec dell'ospedale BICHAT e serie di aliquote inviate all'istituto Pasteur su richiesta. Aliquote identiche verranno utilizzate per dosare le IgG specifiche anti ammonio quaternario e le IgE specifiche come attualmente eseguito presso l'Unità d'Autoimmunità immunologica e ipersensibilità presso l'Ospedale BICHAT.

Una volta eseguiti, i fluidi dell'aspirazione bronchiale saranno conservati in parte per lo studio dei NET nell'Unity d'Immunologic Autoimmunity et Hypersensibility presso l'Ospedale BICHAT, e in parte per l'analisi del contenuto cellulare e dei livelli di PAF presso l'Istituto Pasteur, e di conseguenza consegnato lo stesso giornata nei rispettivi laboratori.

I prick test cutanei verranno eseguiti durante il consulto di allergologia-anestesia da 6 a 10 settimane dopo la reazione anafilattica.

A seguito di ogni inclusione, ogni ospedale invierà, come è prassi medica corrente, informazioni sul paziente: età, sesso, tipo di intervento chirurgico programmato, natura degli anestetici utilizzati, anamnesi di eventi atopici tra cui asma, allergia ad alimenti o farmaci, fattori di comorbilità. I pazienti di controllo saranno inclusi solo presso l'ospedale BICHAT.

Principali criteri di giudizio:

1. Percentuale di neutrofili attivati ​​circolanti nel gruppo di pazienti immediatamente dopo uno shock indotto da farmaci bloccanti neuromuscolari (caso) rispetto a quella del gruppo di pazienti esposti a farmaci bloccanti neuromuscolari durante l'anestesia senza sviluppare uno shock (controllo). Questa misura sarà basata sull'intensità di espressione del marcatore di attivazione CD62L (L-selectina) da parte dei neutrofili del sangue mediante citometria a flusso. I nostri dati preliminari indicano che l'intensità media di fluorescenza (MFI) di CD62L è >450 se si considerano neutrofili "non attivati" e CD62L(MFI)<300 se si considerano neutrofili "attivati".
2. Livelli di PAF nel plasma dei "casi" rispetto al plasma dei "controlli".

Criteri secondari di giudizio:

1. Livelli di IgG specifiche anti-ammonio quaternario nel plasma dei "casi" rispetto al plasma dei "controlli".
2. Capacità di attivazione ex vivo dei neutrofili del sangue in presenza di immunocomplessi farmaco-IgG bloccanti neuromuscolari

3. Presenza di trappole extracellulari di neutrofili nel liquido di aspirazione bronchiale dei "casi"

   Descrizione della popolazione di pazienti: Verrà eseguita una descrizione completa dell'intera popolazione studiata e dei gruppi. Le variabili saranno descritte secondo la loro distribuzione appropriata (media e deviazione standard per variabili con distribuzione normale; mediana e range interquartile per variabili con distribuzioni anormali; frequenza e percentuale per criteri di categoria).

   Analisi - La distribuzione delle variabili che rappresentano la percentuale di neutrofili attivati ​​tra casi e controlli, così come ogni criterio di giudizio secondario sarà confrontata utilizzando una regressione logica condizionale, adattandosi ai criteri di corrispondenza - Per valutare la correlazione tra la percentuale di neutrofili attivati ​​e il gravità dello shock, o tra il livello di IgG specifiche e la gravità dello shock, verrà eseguito un test di tendenza lineare in un modello lineare generale.

   • Verrà inoltre eseguita un'analisi dei risultati ottenuti in sottogruppi di pazienti definiti in base alla gravità dello shock subito
   • I test statistici saranno bilaterali e il rischio di primo grado sarà fissato al 5%.

   • Descrizione dei parametri funzionali dei neutrofili ematici allo stadio basale o dopo stimolazione con complessi farmaco bloccante neuromuscolare-IgG (espressione di FcRs e di marcatori di attivazione, rilascio di mediatori, induzione di NET) e descrizione dei parametri immunologici "classici" del shock anafilattico da farmaci bloccanti neuromuscolari (risultati del prick test, potenziale di attivazione ex vivo dei basofili).

     Verranno eseguiti 5 studi complementari su campioni di pazienti inclusi nello studio della NASA:

   • IPAAQ (Identificazione ed effetti patologici degli anticorpi anti-ammonio quaternario), poiché richiederà un campione aggiuntivo di 10 ml di sieri, sarà ottenuto un consenso firmato specifico da ogni paziente incluso nello studio IPAAQ. Questo campione di siero verrà prelevato durante la visita allergologica programmata da 6 a 10 settimane dopo lo shock anafilattico.

   Lo scopo di questo studio è quantificare, identificare e purificare le diverse sottoclassi IgG di anticorpi anti-ammonio quaternario nei sieri di pazienti che hanno subito uno shock anafilattico durante l'anestesia. Verrà valutata la capacità di immunocomplessi, costituiti da anticorpi anti-ammonio quaternario e da un agente bloccante neuromuscolare, di legare i recettori IgG umani e/o di attivare neutrofili e basofili umani in vitro. Questa analisi consentirà di determinare se i complessi anti-IgG ammonio quaternario-bloccante neuromuscolare possono essere patogeni e di validare il test diagnostico IgG anti-ammonio quaternario, in aggiunta al test IgE anti-ammonio quaternario eseguito durante la normale pratica clinica.

   • NASAmAbs: diverse popolazioni di linfociti B memoria (in particolare IgG o IgE +) diretti contro un ammonio quaternario saranno isolate dalle PBMC di due "casi" che hanno accettato di partecipare allo studio NASAmAbs, mediante citometria a flusso utilizzando un ammonio quaternario (QA) accoppiato a una proteina fluorescente (es. KLH). I geni che codificano i domini variabili delle immunoglobuline a catena pesante e leggera (IgH e IgL) espressi da ciascuna cellula B saranno prima amplificati mediante RT-PCR, quindi clonati in vettori che codificano i domini costanti delle immunoglobuline. Questi vettori saranno trasfettati in linee cellulari e i risultanti anticorpi monoclonali ricombinanti (chimerici uomo-topo) saranno prodotti e caratterizzati in termini di reattività specifica contro agenti bloccanti neuromuscolari QA (per ELISA), affinità per il ligando (mediante metodo di risonanza magnetica superficiale ), e poli e autoreattività (tramite ELISA e immunofluorescenza indiretta). L'anticorpo ricombinante sarà valutato per la sua capacità di attivare cellule in vitro in presenza di antigene (QA o NMBA) e per la sua capacità di indurre shock anafilattico in vivo, in modelli murini transgenici che esprimono il recettore umano per l'anticorpo.

   Lo scopo di questo progetto è quello di generare anticorpi umani ricombinanti anti-ammonio quaternario per valutarne il potenziale patologico (anafilattogeno).

   Nell'ambito dello studio NASAmAbs, verrà raccolta 1 sacca aggiuntiva di sangue EDTA da 250 ml durante un consulto con l'allergologo o durante una visita a tale scopo.

   - NASA LYMPHAQ: La presenza di cellule T specifiche per allergeni da farmaci è documentata nell'allergia alla penicillina, ma non è stata descritta la loro presenza e le caratteristiche nell'allergia immediata ai miorilassanti. Lo scopo del nostro studio ausiliario è evidenziare queste cellule T mediante specifici test di attivazione, per caratterizzare fenotipicamente, quantificare e confrontare la loro frequenza con quella dei donatori sani.

   Lo scopo di questo studio ausiliario è identificare popolazioni specifiche di cellule T per l'ammonio quaternario in pazienti sensibili all'NMBA.

   La ricerca verrà eseguita su cellule mononucleate già isolate durante la visita post-shock nell'ambito dello studio della Nasa.

   • NASA Quin: In un recente studio, il team del Dr. ROUZAIRE ha rivelato un'alta prevalenza di sensibilizzazione al farmaco bloccante neuromuscolare in 17 pazienti allergici ai chinoloni: 53% contro 3,4% in una popolazione di controllo. Come con la folcodina, i chinoloni potrebbero quindi essere un mezzo di sensibilizzazione degli agenti bloccanti neuromuscolari.

   Lo scopo di questo progetto ausiliario è confermare su una coorte più ampia l'associazione di sensibilizzazione tra queste due classi di farmaci, agenti bloccanti neuromuscolari e chinoloni.

   Nell'ambito dello studio NASAQuin, non verranno raccolti ulteriori campioni di sangue. La ricerca sarà effettuata su aliquote di siero e/o plasma conservate nell'ambito dello studio NASA. Per il saggio verrà utilizzata un'aliquota di 300 µl.

   • NASA-CAT: L'anafilassi può causare da sola o durante la somministrazione di adrenalina, malattie cardiache. L'ampiezza, la frequenza e la fisiopatologia dei coinvolgimenti miocardici non sono note.

   Lo scopo dello studio ancillare "NASA-CAT" è definire, utilizzando biomarcatori miocardici plasmatici consolidati, la prevalenza del danno miocardico durante l'anafilassi correlata agli agenti anestetici e il ruolo dell'adrenalina in questo danno. L'adrenalina è una catecolamina che si raccomanda di somministrare per via endovenosa in caso di grave anafilassi. L'adrenalina permette di ripristinare immediatamente la pressione sanguigna grazie alle sue proprietà vasocostrittrici. Nell'insufficienza cardiaca acuta sono stati descritti effetti deleteri dell'adrenalina sulle coronarie e sul miocardio. L'esistenza di effetti simili nell'anafilassi non è nota.

   Lo scopo dello studio "NASA-CAT" è valutare il coinvolgimento del miocardio nell'anafilassi e determinare il ruolo dell'adrenalina in questa lesione.

   Nell'ambito dello studio ausiliario "NASA-CAT", non verranno raccolti ulteriori campioni di sangue. Il dosaggio dei biomarcatori miocardici (troponina ipersensibile, peptidi natriuretici, adrenomedullina, copeptina) sarà eseguito su campioni di 500μl di siero e/o plasma conservati nell'ambito dello studio della NASA.