Papel da Ativação de Neutrófilos na Anafilaxia a Agentes Bloqueadores Neuromusculares (NASA)

Estudo caso-controle, com acompanhamento de 6,10 semanas dos casos

Seleção de casos:

Critérios de inclusão: Qualquer paciente com 18 anos ou mais:

Apresentar sinais clínicos compatíveis com uma reação anafilática perioperatória a drogas bloqueadoras neuromusculares, qualquer que seja o grau da reação anafilática Que foi tratado de acordo com as diretrizes do French Patient Management 2011 (cf. anexo 5) Critérios de não inclusão: paciente falecer durante o choque anafilático

Seleção de controles: Será incluído um controle para cada caso. Os controles serão recrutados exclusivamente no Hospital BICHAT. Os controles devem corresponder ao seguinte:

Critérios de inclusão: Qualquer paciente com idade igual ou superior a 18 anos Hospitalizado para intervenção cirúrgica com necessidade de injeção de medicamento bloqueador neuromuscular, sem desenvolver reação anafilática Que tenha sido informado sobre os detalhes do estudo e que tenha consentido em participar deste estudo

Critérios de não inclusão: mulheres grávidas NB: Se um paciente recrutado como controle sofrer uma reação anafilática após a injeção de drogas bloqueadoras neuromusculares, esse paciente será considerado um caso e outros controles pareados, um para este novo caso e outro para o original paciente do caso.

Emparelhamento: os controles serão emparelhados com os casos com base nos seguintes critérios:

- idade: +/- 5 anos

• sexo
• estado infeccioso: infectado/não infectado
• tipo de cirurgia: as diferentes subclasses são classificadas da seguinte forma: ortopédica, neurocirurgia/visceral, urológica, ginecológica/vascular, cardíaca, toraco/maxilo-facial, oftalmológica, ORL/Outras.
• Classe farmacológica do bloqueador neuromuscular utilizado para cirurgia

Duração do estudo: Duração total: 26 meses Período de inclusão: 24 meses

Duração da participação de um paciente:

Casos: 6 a 10 semanas Controles: dia da cirurgia

Coleta de amostras Casos: no momento do choque (amostra de sangue e plasma e, quando necessário para o paciente, líquido de aspiração brônquica) e durante a consulta de Anestesia de Alergologia 6 a 10 semanas após a reação anafilática Controles: amostra de sangue e plasma após a injeção de injeção de drogas bloqueadoras neuromusculares.

Todas as coletas de sangue (e eventualmente a aspiração de fluidos brônquicos) necessárias para este estudo são realizadas durante o manejo clínico normal de pacientes de caso e de controle, sem nenhum procedimento adicional ou não convencional de intervenção, diagnóstico ou monitoramento do paciente (estudo não intervencional) . São coletados tubos de sangue supranumerários além daqueles coletados durante a prática clínica normal (10 ml em tubo seco para soro/plasma e 10 ml em tubo EDTA) ao mesmo tempo (caso e controles) e o fluido de aspiração brônquica é mantido para análise ao invés de ser descartado.

Um choque anafilático por medicamento bloqueador neuromuscular durante a anestesia surge minutos após a injeção/perfusão. Amostras dos pacientes casos serão, portanto, coletadas nos 30 a 60 minutos após a injeção/perfusão do bloqueador neuromuscular, como já é feito atualmente durante a cirurgia e quando a condição do paciente estiver estabilizada. Os investigadores esperam que as incisões cirúrgicas não sejam realizadas na maioria, se não em todos os pacientes, pois as reações anafiláticas ocorrem antes que as incisões sejam possíveis, ou seja, logo após a injeção/perfusão da droga bloqueadora neuromuscular. Amostras de pacientes controles serão, portanto, coletadas logo após a exposição ao bloqueador neuromuscular e antes da realização das incisões cirúrgicas, para evitar as perturbações induzidas por esse ato cirúrgico, principalmente quanto à ativação de neutrófilos

Volume de sangue coletado especificamente para este estudo:

• paciente do caso: 10 ml após a reação anafilática, e durante a consulta de Alergologia-Anestesia 6 a 10 semanas após o choque le choc.
• Pacientes controle: 20 ml após a injeção de drogas bloqueadoras neuromusculares As amostras coletadas em heparinato de lítio para o estudo celular serão enviadas no dia da reação anafilática e no dia da consulta de Alergologia-Anestesia por um serviço de entrega autorizado para a Unidade Alergológica Molecular et Cellularise no Instituto Pasteur.

As amostras coletadas em tubos secos (amostra de soro) serão alojadas no sero-tec do Hospital BICHAT, e as séries de alíquotas enviadas ao Instituto Pasteur mediante solicitação. Alíquotas idênticas serão utilizadas para dosagem de IgG específica anti-amônia quaternária e IgE específica, conforme atualmente realizado na Unidade de Autoimunidade e Hipersensibilidade Imunológica do Hospital BICHAT.

Quando realizada, os fluidos de aspiração brônquica serão mantidos em parte para o estudo de TNEs na Unidade de Autoimunidade e Hipersensibilidade Imunológica do Hospital BICHAT, e em parte para análise de conteúdo celular e níveis de PAF no Instituto Pasteur, e conseqüentemente entregues os mesmos dia nos respectivos laboratórios.

Testes cutâneos por puntura serão realizados durante a consulta de Alergologia-Anestesia 6 a 10 semanas após a reação anafilática.

Após cada inclusão, cada hospital enviará, conforme prática médica corrente, informações sobre o paciente: idade, sexo, tipo de cirurgia planejada, natureza dos anestésicos utilizados, histórico de eventos atópicos, incluindo asma, alergia a alimentos ou medicamentos, fatores de comorbidade. Os pacientes controles serão incluídos apenas no Hospital BICHAT.

Principais critérios de julgamento:

1. Porcentagem de neutrófilos ativados circulantes no grupo de pacientes imediatamente após choque induzido por bloqueador neuromuscular (caso) em relação ao grupo de pacientes expostos a bloqueador neuromuscular durante anestesia sem choque (controle). Essa medida será baseada na intensidade de expressão do marcador de ativação CD62L (L-selectina) por neutrófilos sanguíneos por meio de citometria de fluxo. Nossos dados preliminares indicam que a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) de CD62L é >450 ao considerar neutrófilos "não ativados" e CD62L(MFI)<300 ao considerar neutrófilos "ativados".
2. Níveis de PAF no plasma de "casos" do que no plasma de "controles".

Critérios de julgamento secundários:

1. Níveis de IgG específica anti-amónio quaternário no plasma de "casos" do que no plasma de "controles".
2. Capacidade de ativação ex vivo de neutrófilos sanguíneos na presença de imunocomplexos IgG-droga bloqueadora neuromuscular

3. Presença de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos no líquido de aspiração brônquica de "casos"

   Descrição da população de pacientes: Será realizada uma descrição completa de toda a população estudada e dos grupos. As variáveis ​​serão descritas de acordo com sua distribuição conforme apropriado (média e desvio padrão para variáveis ​​com distribuição normal; mediana e intervalo interquartílico para variáveis ​​com distribuição anormal; frequência e percentual para critérios de categoria).

   Análise - A distribuição das variáveis ​​que representam a porcentagem de neutrófilos ativados entre casos e controles, bem como cada critério de julgamento secundário será comparada por meio de uma regressão lógica condicional, ajustando nos critérios de pareamento - Avaliar a correlação entre a porcentagem de neutrófilos ativados e a gravidade do choque, ou entre o nível de IgG específico e a gravidade do choque, será realizado um teste de tendência linear em um modelo linear geral.

   • Também será realizada uma análise dos resultados obtidos em subgrupos de pacientes definidos com base na gravidade do choque que sofreram.
   • Os testes estatísticos serão bilaterais e o risco de primeiro grau será fixado em 5%.

   • Descrição dos parâmetros funcionais dos neutrófilos sanguíneos na fase basal ou após estimulação com complexos bloqueadores neuromusculares-IgG (expressão de FcRs e de marcadores de ativação, liberação de mediadores, indução de NETs) e descrição dos parâmetros imunológicos "clássicos" do choque anafilático a drogas bloqueadoras neuromusculares (resultados de testes de puntura, potencial de ativação ex vivo de basófilos).

     5 estudos complementares serão realizados em amostras de pacientes incluídos no estudo da NASA:

   • IPAAQ (Identificação e efeitos patológicos de anticorpos anti-amónio quaternário), uma vez que irá requerer uma amostra adicional de 10 ml de soro, será obtido um consentimento específico assinado de cada paciente incluído no estudo IPAAQ. Esta amostra de soro será coletada durante a consulta de alergologia agendada de 6 a 10 semanas após o choque anafilático.

   O objetivo deste estudo é quantificar, identificar e purificar as diferentes subclasses de IgG de anticorpos antiamônia quaternária no soro de pacientes que sofreram choque anafilático durante a anestesia. Será avaliada a capacidade de imunocomplexos, compostos por anticorpos anti-amônia quaternária e um agente bloqueador neuromuscular, de ligar-se a receptores de IgG humanos e/ou ativar neutrófilos e basófilos humanos in vitro. Esta análise permitirá determinar se os complexos IgG anti-amónio quaternário-bloqueador neuromuscular podem ser patogénicos e validar o teste diagnóstico IgG anti-amónio quaternário, para além do teste IgE anti-amónio quaternário realizado na prática clínica normal.

   • NASAmAbs: Diferentes populações de linfócitos B de memória (particularmente IgG ou IgE+) direcionados contra um quaternário de amônio serão isoladas de PBMCs de dois "casos" que aceitaram participar do estudo NASAmAbs, por citometria de fluxo utilizando um Quaternary Ammonium (QA) acoplado a uma proteína fluorescente (por exemplo, KLH). Os genes que codificam os domínios variáveis ​​das imunoglobulinas de cadeia pesada e leve (IgH e IgL) expressos por cada célula B serão primeiro amplificados por RT-PCR, depois clonados em vetores que codificam os domínios constantes das imunoglobulinas. Esses vetores serão transfectados em linhagens celulares e os anticorpos monoclonais recombinantes resultantes (quimérico humano-camundongo) serão produzidos e caracterizados quanto à reatividade específica contra bloqueadores neuromusculares QA (por ELISA), afinidade pelo ligante (pelo método de ressonância magnética de superfície ) e poli e autorreatividade (por ELISA e imunofluorescência indireta). O anticorpo recombinante será avaliado quanto à capacidade de ativar células in vitro na presença de antígeno (QA ou NMBA) e quanto à capacidade de induzir choque anafilático in vivo, em modelos de camundongos transgênicos expressando receptor humano para o anticorpo.

   O objetivo deste projeto é gerar anticorpos anti-amônia quaternária recombinantes humanos para avaliar seu potencial patológico (anafilactogênico).

   Como parte do estudo NASAmAbs, 1 bolsa adicional de 250ml de EDTA de sangue será coletada durante uma consulta com o alergologista ou durante uma visita para esse fim.

   - NASA LYMPHAQ: A presença de células T específicas para alérgenos de drogas está documentada na alergia à penicilina, mas sua presença e características na alergia imediata a relaxantes musculares não foram descritas. O objetivo do nosso estudo auxiliar é destacar essas células T por testes de ativação específicos, caracterizar fenotipicamente, quantificar e comparar sua frequência com a de doadores saudáveis.

   O objetivo deste estudo auxiliar é identificar populações específicas de células T para amônia quaternária em pacientes sensíveis a NMBA.

   A pesquisa será feita em células mononucleares já isoladas durante a visita pós-choque como parte do estudo da NASA.

   • NASA Quin: Em um estudo recente, a equipe do Dr. ROUZAIRE revelou uma alta prevalência de sensibilização a drogas bloqueadoras neuromusculares em 17 pacientes alérgicos a quinolonas: 53% contra 3,4% em uma população controle. Assim como a folcodina, as quinolonas podem ser uma forma de sensibilização de agentes bloqueadores neuromusculares.

   O objetivo deste projeto auxiliar é confirmar em uma coorte maior, a associação de sensibilização entre essas duas classes de drogas, bloqueadores neuromusculares e quinolonas.

   Como parte do estudo NASAQuin, nenhuma amostra de sangue adicional será coletada. A pesquisa será realizada em alíquotas de soro e/ou plasma conservados como parte do estudo da NASA. Uma alíquota de 300 µl será utilizada para o ensaio.

   • NASA-CAT: A anafilaxia pode causar, isoladamente ou durante a administração de adrenalina, doenças cardíacas. A amplitude, frequência e fisiopatologia dos acometimentos miocárdicos são desconhecidos.

   O objetivo do estudo auxiliar "NASA-CAT" é definir, usando biomarcadores miocárdicos plasmáticos estabelecidos, a prevalência de lesão miocárdica durante anafilaxia relacionada a agentes anestésicos e o papel da adrenalina nessa lesão. A adrenalina é uma catecolamina recomendada para administração intravenosa em anafilaxia grave. A adrenalina permite restaurar imediatamente a pressão arterial devido às suas propriedades vasoconstritoras. Efeitos deletérios da adrenalina nas coronárias e no miocárdio foram descritos na insuficiência cardíaca aguda. A existência de efeitos semelhantes na anafilaxia não é conhecida.

   O objetivo do estudo "NASA-CAT" é avaliar o envolvimento do miocárdio na anafilaxia e determinar o papel da adrenalina nessa lesão.

   Como parte do estudo auxiliar "NASA-CAT", nenhuma amostra de sangue adicional será coletada. A dosagem de biomarcadores miocárdicos (troponina hipersensível, peptídeos natriuréticos, adrenomedulina, copeptina) será realizada em amostras de 500μl de soro e/ou plasma armazenadas como parte do estudo da NASA.