Identification des sous-ensembles de cellules B responsables de la réponse anti-pneumococcique (PNEUMOVACB)

Le but de cette étude est d'identifier quel(s) sous-ensemble(s) spécifique(s) de lymphocytes B est/sont responsable(s) de la production de polysaccharides capsulaires anti-pneumococciques protecteurs IgM, IgG2 et IgA (capPS) en réponse à l'immunisation d'individus sains avec le Pneumovax, un vaccin prototypique de type 2 T-indépendant. En d'autres termes, de quelles cellules B dérivent les plasmocytes sécrétant des IgM, G2 et A ? Pour répondre à cette question, il sera mis à profit la signature VDJ unique de la chaîne lourde d'Ig exprimée par chaque clone de cellule B et la stratégie reposera sur la recherche de filiations clonales entre plasmablastes (PB)/cellules plasmatiques (PC) et différentes cellules B. sous-populations. Par conséquent, les individus en bonne santé seront vaccinés avec Pneumovax et des échantillons de sang seront prélevés aux jours 0, 7, 14, 28 et 56. A partir de ces échantillons sanguins, différents sous-ensembles de lymphocytes B (en particulier IgM+IgD+CD27+ et lymphocytes B à mémoire commutée IgM-IgD-CD27+) et les PB/PC culminant au jour 7 après la vaccination seront isolés par tri cellulaire. Les PB sécrétant CapPS ne peuvent pas être spécifiquement isolés, mais les chercheurs supposent qu'ils représenteront la majorité des PB/PC isolés au pic de la réponse. Ainsi, le jour 7-PB/PC sera trié à la fois en vrac ou sous forme de cellules individuelles dans des plaques PCR à 96 puits. L'ARN sera extrait de PB/PC triés en vrac, et les transcrits d'Ig VDJ-µ, -alpha et -gamma seront amplifiés par RT-PCR et analysés par la méthode de spectrotypage H-CDR afin d'identifier la séquence de signatures VDJ dominantes qui correspondent très probablement à des cellules sécrétant des anti-capPS. En parallèle, pour chaque cellule unique PB/PC, les transcrits des gènes de la chaîne légère Ig lourde et Ig correspondante seront amplifiés par RT-PCR nichée, séquencés et, à condition que la chaîne lourde contienne une signature VDJ dominante, ils seront clonés en expression eucaryote vecteurs pour produire des Acs humains monoclonaux. Les anticorps recombinants seront ensuite testés pour leur réactivité contre capPS du vaccin par ELISA. Lorsque les signatures VDJ de capPS seront validées, avec ce puissant outil moléculaire, les chercheurs rechercheront la présence de ces signatures par PCR spécifique VDJ sur l'ADNc préparé à partir des différents sous-ensembles de cellules B.