Identyfikacja podzbiorów komórek B odpowiedzialnych za odpowiedź przeciw pneumokokom (PNEUMOVACB)

Celem tego badania jest określenie, które specyficzne podzbiory limfocytów B są odpowiedzialne za wytwarzanie ochronnych polisacharydów otoczkowych IgM, IgG2 i IgA przeciw pneumokokom (capPS) w odpowiedzi na immunizację zdrowych osobników szczepionką Pneumovax, prototypowa szczepionka T-niezależna typu 2. Innymi słowy, z których komórek B pochodzą komórki plazmatyczne wydzielające IgM, G2 i A? Aby odpowiedzieć na to pytanie, zostanie wykorzystana unikalna sygnatura VDJ łańcucha ciężkiego Ig wyrażona przez każdy klon komórek B, a strategia będzie polegać na poszukiwaniu klonalnych filiacji między plazmablastami (PB) / komórkami plazmatycznymi (PC) i różnymi komórkami B subpopulacje. W związku z tym osoby zdrowe zostaną zaszczepione szczepionką Pneumovax, a próbki krwi zostaną pobrane w dniach 0, 7, 14, 28 i 56. Wychodząc z tych próbek krwi, różne podzbiory komórek B (w szczególności IgM+IgD+CD27+ i komórki B z przełączaną pamięcią IgM-IgD-CD27+) oraz PB/PC osiągające maksimum w dniu 7 po szczepieniu zostaną wyizolowane przez sortowanie komórek. PB wydzielające CapPS nie mogą być specyficznie izolowane, ale badacze zakładają, że będą one reprezentować większość izolowanych PB/PC w szczycie odpowiedzi. Zatem dzień 7-PB/PC będzie sortowany zarówno w masie, jak i jako pojedyncze komórki w 96-dołkowych płytkach do PCR. RNA zostanie wyekstrahowany z masowo sortowanych PB/PC, a transkrypty VDJ-µ, -alfa i -gamma Ig zostaną zamplifikowane za pomocą RT-PCR i przeanalizowane metodą spektratypowania H-CDR w celu zidentyfikowania sekwencji dominujących sygnatur VDJ, które najprawdopodobniej odpowiadają komórkom wydzielającym anty-capPS. Równolegle, dla każdej pojedynczej komórki PB/PC, transkrypty genów łańcucha ciężkiego Ig i odpowiedniego łańcucha lekkiego Ig będą amplifikowane przez zagnieżdżoną reakcję RT-PCR, sekwencjonowane i pod warunkiem, że łańcuch ciężki zawiera dominującą sygnaturę VDJ, zostaną sklonowane do ekspresji eukariotycznej wektory do wytwarzania monoklonalnych ludzkich Abs. Zrekombinowane przeciwciała zostaną następnie przetestowane pod kątem reaktywności przeciwko capPS ze szczepionki za pomocą testu ELISA. Kiedy sygnatury VDJ capPS zostaną zweryfikowane za pomocą tego potężnego narzędzia molekularnego, badacze będą szukać obecności tych sygnatur poprzez PCR specyficzny dla VDJ na cDNA przygotowanym z różnych podzbiorów komórek B.