Identificatie van de B-celsubsets die verantwoordelijk zijn voor de antipneumokokkenrespons (PNEUMOVACB)

Het doel van deze studie is om te identificeren welke specifieke B-cel subset(s) verantwoordelijk is/zijn voor de productie van beschermende IgM, IgG2 en IgA anti-pneumokokken capsulaire polysacchariden (capPS) als reactie op immunisatie van gezonde individuen met de Pneumovax, een prototypisch T-onafhankelijk type 2-vaccin. Met andere woorden, van welke B-cellen zijn IgM-, G2- en A-secreterende plasmacellen afgeleid? Om deze vraag te beantwoorden, zal gebruik worden gemaakt van de unieke Ig zware keten VDJ-handtekening die door elke B-celkloon tot uitdrukking wordt gebracht en de strategie zal berusten op het zoeken naar klonale verbindingen tussen plasmablasten (PB)/plasmacellen (PC) en verschillende B-cel subpopulaties. Daarom zullen gezonde personen worden gevaccineerd met Pneumovax en zullen er bloedmonsters worden genomen op dag 0, 7, 14, 28 en 56. Uitgaande van deze bloedmonsters, zullen verschillende subgroepen van B-cellen (in het bijzonder IgM+IgD+CD27+ en geschakelde geheugen IgM-IgD-CD27+ B-cellen) en de PB/PC piek op dag 7 na vaccinatie worden geïsoleerd door middel van celsortering. CapPS-uitscheidende PB kan niet specifiek worden geïsoleerd, maar de onderzoekers gaan ervan uit dat zij de meerderheid van de geïsoleerde PB/PC zullen vertegenwoordigen op het hoogtepunt van de respons. Zo zal dag 7-PB/PC zowel in bulk als als afzonderlijke cellen in PCR-platen met 96 putjes worden gesorteerd. RNA zal worden geëxtraheerd uit in bulk gesorteerde PB/PC, en VDJ-µ, -alpha en -gamma Ig transcripten zullen worden geamplificeerd door RT-PCR en geanalyseerd door de H-CDR spectratyperingsmethode om de sequentie van dominante VDJ-handtekeningen te identificeren die komen hoogstwaarschijnlijk overeen met anti-capPS-uitscheidende cellen. Tegelijkertijd zullen voor elke PB/PC-enkele cel Ig-zware en overeenkomstige Ig-lichte-keten-gentranscripten worden geamplificeerd door geneste RT-PCR, gesequenced, en op voorwaarde dat de zware keten een dominante VDJ-handtekening bevat, zullen ze worden gekloond in eukaryotische expressie vectoren om monoklonale menselijke Abs te produceren. De recombinante antilichamen worden vervolgens door middel van ELISA getest op reactiviteit tegen capPS uit het vaccin. Wanneer VDJ-handtekeningen van capPS zullen worden gevalideerd, zullen de onderzoekers met dit krachtige moleculaire hulpmiddel zoeken naar de aanwezigheid van deze handtekeningen door middel van VDJ-specifieke PCR op cDNA dat is bereid uit de verschillende B-celsubsets.