Identificación de los subconjuntos de células B responsables de la respuesta antineumocócica (PNEUMOVACB)

El objetivo de este estudio es identificar qué subconjunto específico de células B es responsable de la producción de polisacáridos capsulares antineumocócicos (capPS) IgM, IgG2 e IgA protectores en respuesta a la inmunización de individuos sanos con Pneumovax, un vacuna tipo 2 prototípica T-independiente. En otras palabras, ¿de qué células B se derivan las células plasmáticas secretoras de IgM, G2 y A? Para abordar esta cuestión, se aprovechará la firma única de VDJ de la cadena pesada de Ig expresada por cada clon de células B y la estrategia se basará en la búsqueda de filiaciones clonales entre plasmablastos (PB)/células plasmáticas (PC) y diferentes células B. subpoblaciones Por lo tanto, se vacunará a individuos sanos con Pneumovax y se tomarán muestras de sangre los días 0, 7, 14, 28 y 56. A partir de estas muestras de sangre, se aislarán diferentes subconjuntos de células B (en particular, IgM+IgD+CD27+ y células B IgM-IgD-CD27+ de memoria conmutada) y el pico de PB/PC en el día 7 después de la vacunación mediante clasificación celular. Los PB secretores de CapPS no se pueden aislar específicamente, pero los investigadores asumen que representarán la mayoría de los PB/PC aislados en el pico de la respuesta. Por lo tanto, el día 7-PB/PC se clasificará a granel o como células individuales en placas de PCR de 96 pocillos. El ARN se extraerá de PB/PC clasificados a granel, y los transcritos de VDJ-µ, -alfa y -gamma Ig se amplificarán mediante RT-PCR y se analizarán mediante el método de espectrotipado H-CDR para identificar la secuencia de las firmas dominantes de VDJ que lo más probable es que correspondan a células secretoras de anti-capPS. Paralelamente, para cada célula única de PB/PC, los transcritos del gen de la cadena pesada de Ig y de la cadena ligera de Ig correspondientes se amplificarán mediante RT-PCR anidada, se secuenciarán y, siempre que la cadena pesada contenga una firma VDJ dominante, se clonarán en la expresión eucariótica. vectores para producir Abs humanos monoclonales. A continuación, se analizará la reactividad de los anticuerpos recombinantes contra capPS de la vacuna mediante ELISA. Cuando se validen las firmas VDJ de capPS, con esta poderosa herramienta molecular, los investigadores buscarán la presencia de estas firmas a través de PCR específica de VDJ en ADNc preparado a partir de los diferentes subconjuntos de células B.