Identifiering av B-cellsundergrupperna som ansvarar för anti-pneumokocksvar (PNEUMOVACB)

Syftet med denna studie är att identifiera vilka specifika B-cellsundergrupper som är ansvariga för produktionen av skyddande IgM, IgG2 och IgA anti-pneumokockkapselpolysackarider (capPS) som svar på immunisering av friska individer med Pneumovax, en prototypiskt T-oberoende typ 2-vaccin. Med andra ord, från vilka B-celler kommer IgM-, G2- och A-utsöndrande plasmaceller? För att ta itu med denna fråga kommer den att utnyttjas av den unika Ig tunga kedjans VDJ-signatur som uttrycks av varje B-cellsklon och strategin kommer att förlita sig på sökningen av klonala filiationer mellan plasmablaster (PB)/plasmaceller (PC) och olika B-celler delpopulationer. Därför kommer friska individer att vaccineras med Pneumovax, och blodprover kommer att tas dag 0, 7, 14, 28 och 56. Med utgångspunkt från dessa blodprover, kommer olika B-cellsundergrupper (särskilt IgM+IgD+CD27+ och switchade minnes-IgM-IgD-CD27+ B-celler) och PB/PC som toppar på dag 7 efter vaccination att isoleras genom cellsortering. CapPS-utsöndrande PB kan inte isoleras specifikt, men utredarna antar att de kommer att representera majoriteten av den isolerade PB/PC vid toppen av svaret. Således kommer dag 7-PB/PC att sorteras både i bulk eller som enstaka celler i 96-brunnars PCR-plattor. RNA kommer att extraheras från bulksorterade PB/PC, och VDJ-µ, -alfa och -gamma Ig-transkript kommer att amplifieras med RT-PCR och analyseras med H-CDR-spektratypningsmetoden för att identifiera sekvensen av dominerande VDJ-signaturer som mest sannolikt motsvarar anti-capPS-utsöndrande celler. Parallellt, för varje PB/PC-enkelcell, kommer Ig-tunga och motsvarande lätta Ig-gentranskript att amplifieras med kapslade RT-PCR, sekvenseras, och förutsatt att den tunga kedjan innehåller en dominant VDJ-signatur, kommer de att klonas till eukaryotiskt uttryck. vektorer för att producera monoklonala humana Abs. De rekombinanta antikropparna kommer sedan att testas för reaktivitet mot capPS från vaccinet med ELISA. När VDJ-signaturer för capPS kommer att valideras, med detta kraftfulla molekylära verktyg, kommer utredarna att leta efter närvaron av dessa signaturer genom VDJ-specifik PCR på cDNA framställt från de olika B-cellsundergrupperna.