Identifizierung der B-Zell-Untergruppen, die für die Anti-Pneumokokken-Reaktion verantwortlich sind (PNEUMOVACB)

Ziel dieser Studie ist es, herauszufinden, welche spezifische(n) B-Zell-Untergruppe(n) für die Produktion von schützenden IgM-, IgG2- und IgA-Anti-Pneumokokken-Kapselpolysacchariden (capPS) als Reaktion auf die Immunisierung gesunder Personen mit Pneumovax, a, verantwortlich ist/sind prototypischer T-unabhängiger Typ-2-Impfstoff. Mit anderen Worten: Aus welchen B-Zellen stammen die IgM-, G2- und A-sezernierenden Plasmazellen? Um diese Frage zu beantworten, wird die einzigartige VDJ-Signatur der schweren Ig-Kette genutzt, die von jedem B-Zellklon ausgedrückt wird, und die Strategie wird auf der Suche nach klonalen Filiationen zwischen Plasmablasten (PB)/Plasmazellen (PC) und verschiedenen B-Zellen basieren Subpopulationen. Daher werden gesunde Personen mit Pneumovax geimpft und Blutproben werden an den Tagen 0, 7, 14, 28 und 56 entnommen. Ausgehend von diesen Blutproben werden durch Zellsortierung verschiedene B-Zell-Untergruppen (insbesondere IgM+IgD+CD27+- und Switched-Gedächtnis-IgM-IgD-CD27+-B-Zellen) und der PB/PC-Höhepunkt am Tag 7 nach der Impfung isoliert. CapPS-sekretierende PB können nicht spezifisch isoliert werden, die Forscher gehen jedoch davon aus, dass sie auf dem Höhepunkt der Reaktion den Großteil der isolierten PB/PC ausmachen. Somit wird Tag 7-PB/PC sowohl in großen Mengen als auch als einzelne Zellen in 96-Well-PCR-Platten sortiert. RNA wird aus massensortiertem PB/PC extrahiert und VDJ-µ-, -alpha- und -gamma-Ig-Transkripte werden durch RT-PCR amplifiziert und durch die H-CDR-Spektratypisierungsmethode analysiert, um die Sequenz der dominanten VDJ-Signaturen zu identifizieren entsprechen höchstwahrscheinlich Anti-capPS-sekretierenden Zellen. Parallel dazu werden für jede PB/PC-Einzelzelle die Gentranskripte der schweren Ig-Kette und der entsprechenden leichten Ig-Kette durch eingebettete RT-PCR amplifiziert, sequenziert und unter der Voraussetzung, dass die schwere Kette eine dominante VDJ-Signatur enthält, in die eukaryontische Expression kloniert Vektoren zur Herstellung monoklonaler menschlicher Abs. Die rekombinanten Antikörper werden dann mittels ELISA auf Reaktivität gegen capPS aus dem Impfstoff getestet. Wenn die VDJ-Signaturen von capPS mit diesem leistungsstarken molekularen Werkzeug validiert werden, werden die Forscher durch VDJ-spezifische PCR auf cDNA, die aus den verschiedenen B-Zell-Untergruppen hergestellt wurde, nach dem Vorhandensein dieser Signaturen suchen.