Identificação dos subconjuntos de células B responsáveis ​​pela resposta antipneumocócica (PNEUMOVACB)

O objetivo deste estudo é identificar qual(is) subconjunto(s) específico(s) de células B é(são) responsável(is) pela produção de polissacarídeos capsulares anti-pneumocócicos IgM, IgG2 e IgA protetores (capPS) em resposta à imunização de indivíduos saudáveis ​​com o Pneumovax, um vacina tipo 2 prototípica independente de T. Em outras palavras, de quais células B são derivadas as células plasmáticas secretoras de IgM, G2 e A? Para responder a esta questão, será aproveitada a assinatura única de VDJ de cadeia pesada de Ig expressa por cada clone de célula B e a estratégia contará com a busca de filiações clonais entre plasmablastos (PB)/células plasmáticas (PC) e diferentes células B subpopulações. Portanto, indivíduos saudáveis ​​serão vacinados com Pneumovax, e amostras de sangue serão coletadas nos dias 0, 7, 14, 28 e 56. A partir dessas amostras de sangue, diferentes subconjuntos de células B (em particular IgM+IgD+CD27+ e células B de memória comutada IgM-IgD-CD27+) e o pico de PB/PC no dia 7 após a vacinação serão isolados por separação de células. Os PB secretores de CapPS não podem ser especificamente isolados, mas os investigadores assumem que eles representarão a maioria dos PB/PC isolados no pico da resposta. Assim, dia 7-PB/PC serão classificados em massa ou como células individuais em placas de PCR de 96 poços. O RNA será extraído de PB/PC bulk sorted, e os transcritos VDJ-µ, -alpha e -gamma Ig serão amplificados por RT-PCR e analisados ​​pelo método de espectrotipagem H-CDR para identificar a sequência de assinaturas VDJ dominantes que muito provavelmente correspondem a células secretoras de anti-capPS. Paralelamente, para cada célula única de PB/PC, os transcritos dos genes da cadeia pesada de Ig pesada e correspondente da cadeia leve serão amplificados por nested RT-PCR, sequenciados e, desde que a cadeia pesada contenha uma assinatura VDJ dominante, eles serão clonados em expressão eucariótica vetores para produzir Abs humanos monoclonais. Os anticorpos recombinantes serão então testados quanto à reatividade contra capPS da vacina por ELISA. Quando as assinaturas VDJ de capPS forem validadas, com esta poderosa ferramenta molecular, os investigadores procurarão a presença dessas assinaturas por PCR específico de VDJ em cDNA preparado a partir de diferentes subconjuntos de células B.