Идентификация субпопуляций В-клеток, ответственных за противопневмококковый ответ (PNEUMOVACB)

Целью данного исследования является определение того, какие специфические подмножества В-клеток ответственны за выработку защитных IgM, IgG2 и IgA против пневмококковых капсулярных полисахаридов (capPS) в ответ на иммунизацию здоровых людей вакциной Pneumovax. прототип Т-независимой вакцины типа 2. Другими словами, из каких В-клеток происходят IgM, G2 и A-секретирующие плазматические клетки? Для ответа на этот вопрос будет использована уникальная сигнатура VDJ тяжелой цепи Ig, экспрессируемая каждым клоном В-клеток, и стратегия будет основываться на поиске клональных связей между плазмобластами (PB)/плазматическими клетками (PC) и различными B-клетками. субпопуляции. Таким образом, здоровые люди будут вакцинированы пневмоваксом, а образцы крови будут взяты на 0, 7, 14, 28 и 56 день. Начиная с этих образцов крови, путем сортировки клеток будут выделены различные субпопуляции В-клеток (в частности, IgM+IgD+CD27+ и переключаемые В-клетки памяти IgM-IgD-CD27+) и PB/PC с пиком на 7-й день после вакцинации. CapPS-секретирующие PB не могут быть специально выделены, но исследователи предполагают, что они будут представлять большую часть изолированных PB/PC на пике ответа. Таким образом, день 7-PB/PC будет отсортирован как в массе, так и в виде отдельных клеток в 96-луночных планшетах для ПЦР. РНК будет извлечена из отсортированных в массе PB/PC, а транскрипты VDJ-µ, -альфа и -гамма Ig будут амплифицированы с помощью ОТ-ПЦР и проанализированы методом спектротипирования H-CDR, чтобы идентифицировать последовательность доминирующих сигнатур VDJ, которые скорее всего, соответствуют анти-capPS-секретирующим клеткам. Параллельно для каждой отдельной клетки PB/PC транскрипты генов тяжелой цепи Ig и соответствующей легкой цепи Ig будут амплифицировать с помощью вложенной ОТ-ПЦР, секвенировать и, при условии, что тяжелая цепь содержит доминантный признак VDJ, они будут клонированы в эукариотическую экспрессию. векторы для получения моноклональных антител человека. Затем рекомбинантные антитела будут проверены на реактивность против capPS из вакцины с помощью ELISA. Когда VDJ-сигнатуры capPS будут проверены с помощью этого мощного молекулярного инструмента, исследователи будут искать наличие этих сигнатур с помощью VDJ-специфической ПЦР на кДНК, полученной из различных субпопуляций В-клеток.